[發明專利]梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201811076255.0
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109212209A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 劉莉莉;楊天賜;童曼莉;林勇;朱曉楨;林麗蓉;張長弓
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院;廈門市波生生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/571
• 分類號: G01N33/571;G01N33/535;G01N33/92
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒及其制備方法，涉及梅毒螺旋體。梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒設有心磷脂抗原包被微孔板、辣根過氧化物酶標記的抗人Ig單克隆抗體、顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、校準品和外包裝盒。1)提取梅毒螺旋體外膜；2)提取梅毒螺旋體心磷脂抗原；3)制備心磷脂抗原包被微孔板；4)制備抗人Ig單克隆抗體；5)標記抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶；6)提供校準品；7)提供顯色液A；8)提供顯色液B；9)制備濃縮洗滌液；10)制備反應終止液；11)制備梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒。采用梅毒螺旋體來源的心磷脂抗原，實現梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測。

技術領域

本發明涉及梅毒螺旋體，尤其是涉及可獲得梅毒螺旋體來源的心磷脂抗原，采用定量檢測方法的梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病，近年來在國內的發病率逐年上升，梅毒的防控已列為我國公共衛生服務的主要任務之一。

梅毒螺旋體尚不能在體外培養，而直接病原學，如暗視野顯微鏡檢查和鍍銀染色陽性率不高。血清學實驗是梅毒臨床診斷和療效監測的主要方法，實驗包括非特異性抗體和特異性抗體檢測，非特異性抗體(也稱心磷脂抗體)主要包括性病研究試驗室玻片實驗(VDRL)、不加熱血清反應素試驗(USR)、快速血漿反應素環狀卡片試驗(RPR)和甲苯胺紅不加熱試驗(TRUST)等。其原理基本相同，均采用牛的心磷脂為抗原，與卵磷脂和膽固醇按照一定的比例進行混合，組成抗原顆粒，當抗原顆粒與梅毒心磷脂抗體反應后出現凝集現象(童曼莉,劉莉莉,林麗蓉,張惠林，楊天賜.梅毒實驗診斷程序研究進展[J].中華檢驗醫學雜志,2017,40(11))。臨床通常將樣本進行倍比稀釋進行梅毒心磷脂抗體的滴度檢測，以監測梅毒的治療效果。但不能進行定量檢測，無法判斷患者梅毒心磷脂抗體的消長規律，不能提供疾病的治療效果和預后的客觀指標。

發明內容

本發明的目的在于提供可獲得梅毒螺旋體來源的心磷脂抗原，定量分析梅毒螺旋體心磷脂抗體，實現梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測，可作為梅毒治療效果和預后客觀指標的梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒及其制備方法。

所述梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒設有心磷脂抗原包被微孔板、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人Ig單克隆抗體、顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、校準品和外包裝盒；所述辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人Ig單克隆抗體、顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液和校準品均裝在相應的聚乙烯瓶中并與心磷脂抗原包被微孔板一起裝在外包裝盒內。

所述梅毒螺旋體心磷脂抗體定量檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟：

1)提取梅毒螺旋體外膜；

在步驟1)中，所述提取梅毒螺旋體外膜的具體方法可為：用超聲裂解器充分裂解梅毒螺旋體，8000r/min 4℃離心20min除去大的細菌碎片，100 000g 4℃離心2h獲得梅毒螺旋體外膜。

2)提取梅毒螺旋體心磷脂抗原；

在步驟2)中，所述提取梅毒螺旋體心磷脂抗原的具體方法可為：取梅毒螺旋體外膜4mg，加入1mL氯仿和0.5mL甲醇，充分振蕩，并于37℃水浴20min，再加入1.5mL甲醇，振蕩，500g離心5min，留取上清，向上清液中加入3mL氯仿，然后加入1.2mL溶液Ⅰ，500g離心5min，溶液Ⅰ分為2層，用吸管吸走上層溶液，然后沿管壁加入1.2mL溶液Ⅱ，小心旋轉，待分層后再將上層相吸走，重復2次，在微弱氮氣流下將溶劑揮發，獲得梅毒螺旋體心磷脂抗原；所述溶液Ⅰ的組成可為1.80mmol/L CaCl₂、1.79mmol/L MgCl₂和49.57mmol/L NaCl的水溶液；所述溶液Ⅱ的組成可為氯仿、甲醇和水，所述氯仿、甲醇和水的體積比可為3︰48︰47。

3)制備心磷脂抗原包被微孔板；