[發明專利]5-氨基乙酰丙酸生產菌株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201811076004.2
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN110904018B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 鄭平;陳久洲;周文娟;孫際賓;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發明公開了通過增強5?氨基乙酰丙酸生產菌株中丙氨酸:乙醛酸轉氨酶的活性或在5?氨基乙酰丙酸生產菌株中導入外源性的丙氨酸:乙醛酸轉氨酶來構建ALA高產菌株的方法。本發明還公開了利用所述方法構建的ALA高產菌株和利用所述菌株制備ALA的方法。利用本發明的菌株無需添加外源甘氨酸即可高效、低成本、低污染地產生ALA。

技術領域

本發明涉及基因工程和微生物發酵技術領域。具體地說，本發明涉及5-氨基乙酰丙酸生產菌株及其構建方法和應用。

背景技術

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一種重要的高附加值生物基化工產品，在農業、醫藥、飼料、保健品等領域應用廣泛。目前ALA主要通過化學合成法生產，成本高污染重，限制了其在各領域的推廣應用。近年來，利用微生物發酵法合成ALA由于低成本和無污染的優勢而逐漸成為研究的熱點。

生物體內ALA主要有兩種合成途徑，其中碳4(C4)途徑以琥珀酰輔酶A和甘氨酸為底物，由ALA合成酶一步催化直接合成ALA；碳五(C5)途徑以谷氨酸為底物，通過3步催化反應得到ALA。現有技術針對ALA合成的代謝途徑改造包括強化ALA合成途徑中關鍵酶的表達(CN101063104A、CN102206606A)、提升關鍵酶的酶學性質(CN108251396A)、增強四碳回補途徑(CN103981203B)、強化輔酶A供給途徑(CN103710374B)、弱化ALA下游代謝途徑(CN103695364B、CN104830748A)、增強ALA轉運蛋白的表達(CN106047916A、CN106434513A)等策略。

由于只涉及一步酶促反應，C4途徑相對于多步催化反應的C5途徑具有明顯優勢，但其雙底物的供應問題存在較大限制。其中底物琥珀酰輔酶A為TCA循環中間代謝物，目前通過途徑改造基本擺脫了傳統工藝中外源添加琥珀酸的限制(蒲偉等,生物工程學報,2013.10.25,29(10):1494-1503)；但胞內甘氨酸合成途徑不足，現有利用C4途徑合成ALA的菌株和工藝中通常需要外源添加甘氨酸，以保證ALA的過量合成和積累。

細菌體內甘氨酸主要通過絲氨酸合成代謝途徑產生，并伴隨1碳單位的代謝。有研究者試圖利用該途徑，通過對ALA合成菌株代謝工程改造達到甘氨酸胞內合成和供給的目的。例如Ding等在利用C4途徑合成ALA的工程菌株中表達解除絲氨酸反饋抑制的SerA，擬通過打通絲氨酸-甘氨酸代謝通路實現甘氨酸的胞內供給，但ALA產量只比對照菌株提升14％(Ding et al.J Ind Microbiol Biotechnol,2017,44(8):1127-1135)；Zou等在谷氨酸棒狀桿菌中打通絲氨酸合成(serABC)途徑，ALA產量提高70％，進一步強化絲氨酸轉化為甘氨酸的酶(glyA)，ALA產量提高150％，達到了590mg/L(Zou et al.Biotechnology Letters,2017,39(9):1369)。

雖然上述工作已經取得一定成效，但通過絲氨酸合成途徑提供甘氨酸的代謝通路較長，涉及多步酶促反應，且關鍵酶甘油醛-3磷酸脫氫酶受到嚴謹的反饋調控，不僅難以實現甘氨酸的胞內有效供給，而且多酶表達也會加重工程菌的代謝負擔，進而影響菌體的生長和代謝，因此，雖然工程菌株中ALA的產量有所增加，但其最終的產量依然很低，無法滿足工業化規模的生產應用。

因此本領域仍需要構建新的甘氨酸供給途徑，進一步優化構建ALA工程菌株的代謝通路，從而能夠高產量、低成本地制備ALA。

發明內容

本發明的目的在于構建一種5-氨基乙酰丙酸生產菌株，從而能夠高產量、低成本地制備ALA。

在第一方面，本發明提供5-氨基乙酰丙酸生產菌株的構建方法，所述方法包括以下步驟：

增強5-氨基乙酰丙酸生產菌株中丙氨酸:乙醛酸轉氨酶的活性或導入外源性的丙氨酸:乙醛酸轉氨酶。

在具體的實施方式中，所述方法還包括增強菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途徑。