[發明專利]一種超靈敏檢測小鼠IgG的ELISA方法

在審

• 申請號: 201811075581.X
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109085366A
• 公開（公告）日: 2018-12-25
• 發明（設計）人: 冷毅斌;王長樂
• 申請（專利權）人: 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

1.一種超靈敏檢測小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，包括：

通過包被緩沖液稀釋捕捉到小鼠IgG單克隆抗體，100μl/孔，4℃過夜；

小鼠IgG單克隆抗體包被于ELISA板上，100μl/孔，將檢測樣品和標準品與固相化的捕捉抗體保溫，使小鼠IgG與捕捉抗體結合，37℃溫育1h；使結合到固相化捕捉抗體上的小鼠IgG與二抗即兔抗小鼠IgG多克隆抗體結合，37℃溫育1h；加入檢測抗體即羊抗兔IgG-HRP與兔抗小鼠IgG多克隆抗體結合，37℃溫育1h，來檢測小鼠IgG。

2.根據權利要求1所述的超靈敏檢測小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，通過包被緩沖液稀釋捕捉到小鼠IgG單克隆抗體前，還包括：

獲取小鼠脾臟，用生理鹽水清洗干凈后將脾臟放入200目尼龍網中剪碎，放在培養皿中，加10mL EZ-sepMouse 1X小鼠淋巴細胞分離液，用20mL玻璃注射器的活塞進行研磨；

收集分離液至離心管中，加入1mL1640培養液覆蓋，常溫800g離心30min；吸出懸浮在1640培養液和EZ-Sep分離液之間的淋巴細胞層中的淋巴細胞懸液，加入10mL 1640培養基洗滌，250g離心10min；

傾倒上清液，加1640培養液10mL重新懸浮淋巴細胞，細胞計數；根據細胞計數結果，將細胞懸液以1mL胎牛血清、100μL雙抗、需要量的PWM和1640培養液混合成10mL，使最終細胞濃度為5×105/mL；

用不同濃度的PWM與淋巴細胞共培養，分為PWM25μg/mL組，PWM5μg/mL組，PWM1μg/mL組，PWM0.2μg/mL組和Blank組，植入24孔板，每孔1mL，加蓋，置37℃，5％CO₂培養箱中，濕潤環境培養7天；

培養結束，將培養板內細胞培養液吸入1.5mL離心管中，1000g離心10min，取無細胞上清液，-20℃保存備測。

3.根據權利要求1所述的超靈敏檢測小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，包被緩沖液為檸檬酸緩沖液，每升檸檬酸溶液含0.386g二水磷酸二氫鈉、1.93g十二水磷酸氫二鈉和8.2g檸檬酸。

4.根據權利要求1所述的超靈敏檢測小鼠IgG的ELISA方法，其特征在于，來檢測小鼠IgG，具體包括：

洗板，每孔加入TMB底物溶液100μL，室溫避光顯色30min后，每孔加入2mol/L H₂SO₄50μL終止反應；用酶標儀在450nm處檢測OD值；

繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品濃度。