[發明專利]檢測致癇大鼠海馬組織谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法

有效

• 申請號: 201811073624.0
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109030662B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 吳原;雷丹青;曾春梅
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學第一附屬醫院;廣西醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;李航

本發明屬于化學分析領域，提供了檢測致癇大鼠海馬組織谷氨酸及r?氨基丁酸含量的方法，取戊四唑致癇的大鼠海馬組織，冰上勻漿，離心取上清液進行衍生處理，然后進行高效液相色譜檢測谷氨酸及r?氨基丁酸，色譜條件為：采用反向C18柱，流動相包括流動相A和流動相B，流動相A為40?60mmol/L的乙酸鈉溶液和四氫呋喃，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫。本發明的檢測方法步驟簡單，結果精確，檢測快速。

技術領域

本發明涉及化學分析領域，具體涉及檢測致癇大鼠海馬組織谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。

背景技術

癲癇是由于神經元異常放電引起的短暫性腦功能障礙，是一種常見的中樞神經系統綜合征，癲癇持續狀態(SE)是神經內科常見的危重急癥，長時間癲癇發作若不及時控制，可因高熱、循環衰竭或神經元興奮毒性損傷，導致不可逆的腦損傷，致殘率和病死率很高。SE與癲癇終止機制關系密切，因此，探索癲癇發作終止的相關機制，對改善SE患者預后及其重要。目前，有研究指出，抑制性神經遞質及興奮性神經遞質失衡是介導SE的關鍵。r-氨基丁酸(GABA)與谷氨酸(GLU)分別為中樞神經系統中最為重要的抑制性及興奮性神經遞質，兩者失衡是導致SE的重要原因之一。GLU對中樞神經系統有興奮作用，與癲癇的發作起始關系密切，而其代謝產物：GABA，是中樞神經系統抑制性物質，可介導癲癇發作的終止。GLU、GABA的合成及釋放與癲癇的終止關系密切。海馬作為大腦邊緣系統的一部分，與癲癇發作關系密切。因此。研究SE狀態下海馬內GLU、GABA含量及其比值變化，對癲癇持續狀態的發生、發展及其終止有重要意義。

常見的氨基酸檢測方法有離子交換色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳、色譜-質譜聯用等。近年來，柱前衍生反相高效液相色譜法分析氨基酸的發展非常迅速，該方法具有靈敏度高、分析速度快、衍生試劑種類多樣等優點，已經在許多領域得到應用。然而以前的色譜條件相對比較復雜、衍生產物存在不穩定、易降解等缺點，并且成本高。在本實驗中我們摸索出了新的色譜條件，實現了腦內海馬組織中GLU、GABA快捷、省時、低成本且準確度高的測定目的。

發明內容

本發明目的在于提供一種低成本、方便快捷的檢測致癇大鼠海馬組織谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：檢測致癇大鼠海馬組織谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法，包括以下步驟：

(1)致癇大鼠模型的建立：取SD大鼠，用劑量為80mg/kg的戊四唑進行皮下注射，觀察大鼠行為，根據Racine分級標準，選擇IV-V級致癇大鼠作為致癇大鼠模型；

(2)將步驟(1)中得到的所述致癇大鼠達到癲癇發作級別后30min時斷頭取海馬組織，稱取海馬組織，冰上勻漿，取海馬組織勻漿加入50vol％的甲醇溶液，按照每100mg加入1mL甲醇溶液計算，-4℃,12000rpm離心20-30min，取上清與乙腈1:1混合后，-4℃,12000rpm離心20-30min得到的上清液為樣品，并將樣品進行衍生處理；

(3)衍生后的樣品通過高效液相色譜進行檢測，測定樣品中的谷氨酸及r-氨基丁酸含量，色譜條件如下：

色譜柱采用反向C18色譜柱；

流速：1.0mL/min；

柱溫：30-35℃；

檢測波長：265nm；

進樣量：20uL；

流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為40-60mmol/L乙酸鈉溶液和四氫呋喃，二者體積比為99:1，所述乙酸鈉溶液用冰醋酸調節pH至4.8，所述流動相B為乙腈；

采用如下梯度洗脫程序：