[發明專利]流行性造血器官壞死病毒（EHNV）的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑

在審

• 申請號: 201811068906.1
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN110894549A
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: 賈鵬;錢冬;程奇;溫智清;劉葒;張建勛;肖文;余國君;史秀杰;鄭曉聰;王津津;于力;何俊強;劉瑩
• 申請（專利權）人: 杭州眾測生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.一種流行性造血器官壞死病毒（EHNV）核酸的檢測試劑盒，包括：流行性造血器官壞死病毒正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述流行性造血器官壞死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述流行性造血器官壞死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

2.根據權利要求1所述的核酸檢測試劑盒，所述特異性熒光探針的熒光報告基團選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種，熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一種。

3.根據權利要求1和2所述的核酸檢測試劑盒，還包括引物混合液、特異性熒光探針、ABuffer、B Buffer、RAA干粉試劑、流行性造血器官壞死病毒標準品和DEPC處理水中至少一種。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，所述的逆轉錄體系由RTE逆轉錄酶、RNA酶抑制劑組成。

5.根據權利要求3所述的試劑盒，其中，所述A Buffer為20% PEG ；B Buffer為280mMMgAc。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中，所述的RAA干粉試劑的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重組酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶， 30ng/mL RTE逆轉錄酶、 100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L二硫蘇糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

7.根據權利要求1-5任意一項所述的核酸檢測試劑盒，流行性造血器官壞死病毒標準品為含有流行性造血器官壞死病毒保守區基因部分序列的陽性質粒。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，所述含有流行性造血器官壞死病毒保守區基因部分序列的陽性質粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

9.流行性造血器官壞死病毒的RAA恒溫熒光檢測方法，提取待測樣品的RNA，以待測樣品的RNA 為模板，在流行性造血器官壞死病毒的正向引物、反向引物、特異性熒光探針及RAA干粉試劑、A Buffer、B Buffer和DEPC處理水存在下進行實時熒光RAA反應，根據實時熒光RAA擴增曲線分析待測樣品；其中所述流行性造血器官壞死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述流行性造血器官壞死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

10.根據權利要求9所述，流行性造血器官壞死病毒核酸RNA提取采用傳統的Trizol-RNA試劑或者采用等效的RNA提取試劑盒。