[發(fā)明專利]傳染性胰腺壞死病（IPNV）的RAA恒溫?zé)晒鈾z測方法及試劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811068898.0
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN110894548A
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉葒;錢冬;程奇;賈鵬;張建勛;肖文;余國君;史秀杰;鄭曉聰;王津津;于力;何俊強;劉瑩;溫智清
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州眾測生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明公開了一種傳染性胰腺壞死病（IPNV）RAA恒溫?zé)晒鈾z測方法和檢測試劑盒。檢測試劑盒包括一條正向引物SEQ ID NO.1、一條反向引物SEQ ID NO.2、一條特異性熒光探針SEQ ID NO.3、反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、重組聚合酶和對照品。本發(fā)明的試劑盒特異性強；檢測靈敏度高，可達(dá)到0.78fg/μL；準(zhǔn)確度高、可靠；操作簡便快捷，適合現(xiàn)場檢測，具有廣泛的應(yīng)用場景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的檢測方法，具體涉及一種傳染性胰腺壞死病的RAA恒溫?zé)晒鈾z測方法及試劑盒。

背景技術(shù)

傳染性胰腺壞死病((Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)主要感染鮭鱒稚魚，不僅危害大西洋鮭、虹鱒、北極紅點鮭、棕鱒和幾種太平洋大麻哈魚類，還危害一些養(yǎng)殖的海水魚類，海鱸、五條、大菱鲆、歐洲黃蓋鰈、庸鰈、多佛鰨、塞內(nèi)加爾鰨和大西洋鱈等。在世界很多國家特別是大量養(yǎng)殖鮭鱒魚類的國家如美國、日本、加拿大和歐洲等國均有發(fā)生。近年來隨著水生動物進(jìn)口貿(mào)易的增加，傳染性胰臟壞死病已傳入我國并在一些地區(qū)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

IPNV屬于雙鏈RNA病毒科(Birnaviridae)的水生雙鏈RNA病毒屬(Aquabirnavirus)，病毒顆粒呈正20面體，無囊膜。衣殼內(nèi)有由2個片段組成的雙股RNA基因，片段A編碼一個多聚蛋白，包括VP2、VP3、VP4，并通過間隔的ORF編碼一個非結(jié)構(gòu)蛋白VP5；片段B編碼一個依賴于RNA的RNA聚合酶(VP1)。其中VP2是IPNV主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有病毒主要抗原表位和中和抗體表位。經(jīng)常用于病毒的診斷、血清型分類及疫苗設(shè)計。

早期的檢測方法有血清中和試驗、ELISA、RT-PCR等,后來研究發(fā)展的有ISH、FISH、RT-LAMP等。PCR等技術(shù)目前發(fā)展己非常成熟，是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法，被普遍應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的檢測中。但PCR技術(shù)對實驗環(huán)境和操作要求苛刻，產(chǎn)物容易污染，導(dǎo)致假陽性。目前檢測方法正向更特異、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、費用低廉化的方向發(fā)展，但這種方法耗時、特異性低，遠(yuǎn)不能滿足日常快速檢測工作的需要。本發(fā)明建立了RAA恒溫?zé)晒鈦頇z測IPNV的方法，快速方便，準(zhǔn)確可靠，是適應(yīng)口岸快速檢測和大通關(guān)的時代要求，對促進(jìn)中國海洋養(yǎng)殖及其產(chǎn)品的貿(mào)易有重要作用。

重組酶介導(dǎo)擴增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技術(shù)也是一種在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。與RPA不同的是，RAA擴增法使用的是從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級增長，通常在1h內(nèi)即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。在RAA反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個RAA擴增過程，20分鐘內(nèi)，可實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。整個反應(yīng)簡單快速，因為不需要高溫循環(huán)，所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用，適用于食品快速檢測領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供傳染性胰腺壞死病(IPNV)的RAA恒溫?zé)晒夂怂釞z測試劑盒及檢測方法。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種傳染性胰腺壞死病(IPNV)核酸的檢測試劑盒，包括：傳染性胰腺壞死病正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述傳染性胰腺壞死病正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述傳染性胰腺壞死病反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。