[發明專利]傳染性鮭魚貧血癥病毒（ISAV）的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑

在審

• 申請號: 201811068879.8
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN110894547A
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: 賈鵬;錢冬;程奇;溫智清;劉葒;張建勛;肖文;余國君;史秀杰;鄭曉聰;王津津;于力;何俊強;劉瑩
• 申請（專利權）人: 杭州眾測生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發明公開了一種傳染性鮭魚貧血癥病毒（ISAV）RAA恒溫熒光檢測方法和檢測試劑盒。檢測試劑盒包括一條正向引物SEQ ID NO.1、一條反向引物SEQ ID NO.2、一條特異性熒光探針SEQ ID NO.3、反應液、逆轉錄酶、重組聚合酶和對照品。本發明的試劑盒特異性強；檢測靈敏度高，可達到2.72fg/μL；準確度高、可靠；操作簡便快捷，適合現場檢測，具有廣泛的應用場景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及海洋水產養殖業的檢測方法，具體涉及一種傳染性鮭魚貧血癥病毒的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑盒。

背景技術

傳染性鮭魚貧血癥病毒(infectious salmon anaemia virus，ISAV)于1984年在挪威首次出現，是一種海洋病毒，主要感染大西洋鮭魚(Salmo salar)，可引起嚴重貧血、程度不同的出血和多組織壞死，是大西洋鮭魚全身性和致死性的傳染病。傳染性鮭魚貧血癥病毒是一種正粘病毒，直徑100～130nm，由8個基因組片段組成。傳染性鮭魚貧血癥是世界動物衛生組織(OIE)水生動物疫病名錄中的重要疫病之一，主要在歐洲、北美廣泛流行，被列入歐共體魚類健康指令防治的重要病害之一。因此建立快速而準確的ISAV檢測方法，對保護我國的水產養殖業具有重要的意義。

重組酶介導擴增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技術也是一種在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。與RPA不同的是，RAA擴增法使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，反應產物也是以指數級增長，通常在1h內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。在RAA反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監控整個RAA擴增過程，20分鐘內，可實現對起始模板的定量及定性分析。整個反應簡單快速，因為不需要高溫循環，所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用，適用于食品快速檢測領域。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供傳染性鮭魚貧血癥病毒(ISAV)的RAA恒溫熒光核酸檢測試劑盒及檢測方法。

為實現以上目的，本發明采用以下技術方案：

一種傳染性鮭魚貧血癥病毒(ISAV)核酸的檢測試劑盒，包括：傳染性鮭魚貧血癥病毒正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述傳染性鮭魚貧血癥病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述傳染性鮭魚貧血癥病毒反向引物核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

在一些實施方案中，所述特異性熒光探針的熒光報告基團選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種，熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一種。

在一些實施方案中，所述的核酸檢測試劑盒，還包括引物混合液、特異性熒光探針、A Buffer、B Buffer、RAA干粉試劑、傳染性鮭魚貧血癥病毒標準品和DEPC處理水中至少一種。

在一些實施方案中，所述的試劑盒，所述的逆轉錄體系由RTE逆轉錄酶、RNA酶抑制劑組成。

在一些實施方案中，所述的試劑盒，其中，所述A Buffer為20％PEG；B Buffer為280mM MgAc。