[發明專利]鮭魚甲病毒（SAV）的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑

在審

• 申請號: 201811067943.0
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN110894544A
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: 鄭曉聰;錢冬;程奇;史秀杰;劉葒;張建勛;肖文;余國君;賈鵬;王津津;于力;何俊強;劉瑩;溫智清
• 申請（專利權）人: 杭州眾測生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發明公開了一種鮭魚甲病毒（SAV）RAA恒溫熒光檢測方法和檢測試劑盒。檢測試劑盒包括一條正向引物SEQ ID NO.1、一條反向引物SEQ ID NO.2、一條特異性熒光探針SEQ ID NO.3、反應液、逆轉錄酶、重組聚合酶和對照品。本發明的試劑盒特異性強；檢測靈敏度高，可達到1.93fg/μL；準確度高、可靠；操作簡便快捷，適合現場檢測，具有廣泛的應用場景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及海洋水產養殖業的檢測方法，具體涉及一種鮭魚甲病毒的RAA恒溫熒光檢測方法及試劑盒。

背景技術

鮭魚甲病毒((Salmonid alphavirus，SAV)自20世紀90年代末開始流行于愛爾蘭、挪威、英國等國家，主要感染大西洋鮭(Salmo salar)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等鮭科魚類，引起胰腺、心肌炎癥和昏睡等癥狀，致死率達1％～48％，在魚類養殖各生長階段均有爆發。又被稱為鮭魚胰腺病或昏睡病。2013年鮭魚甲病毒感染被列入OIE水生動物疫病名錄中。鮭魚甲病毒隸屬于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒屬(Alphavirus)的RNA型病毒，，球型(直徑55-65nm)，對氯仿敏感，在pH4.0、pH 12.0和60℃時迅速滅活，在氯化銫中的浮力密度為1.20g/mL。

受鮭魚甲病毒感染的病魚一般食欲減退、昏睡、眼突、腹水以及糞便拖尾，無法保持在水中的位置，螺旋或繞圈地游動，或者在水底不動，但抓捕時會游開，有時出現突然死亡。解剖發現病魚心臟蒼白，腸道空虛，有黃色黏液，體內脂肪很少，有時在幽門盲腸和四周的脂肪出現瘀斑出血；胰腺、心肌和骨骼肌病變是比較主要的癥狀。

近年來基于臨床組織病理學、免疫學以及PCR技術等的各種診斷方法已被用于SAV的檢測。但是現有的這些方法都存在一定的不足，例如：基于組織病理學的方法不僅操作繁瑣、費時，而且靈敏度較低；基于免疫學的方法雖然具有敏感性高、檢測快速等特點，可用于大批標本的檢測，但對新鮮樣品進行檢測時出現的假陽性問題在一定程度上還限制著該方法的廣泛應用；而PCR方法敏感、準確、快速，可替代病原學檢測，但由于需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現場快速檢測及基層普及應用。與一般PCR技術相比，熒光PCR檢測技術簡化了操作步驟，而且可消除擴增產物引起的交叉污染，減少假陽性的發生。但實時熒光PCR耗時長，成本較高，目前在水產養殖動物的常規病原體檢測中的應用還不多。LAMP等溫擴增技術同樣由于假陽性較高，準確度低，水產病原檢測中的應用還是比較局限。本發明建立了RAA恒溫熒光來檢測SAV的方法，快速方便，準確可靠，是適應口岸快速檢測和大通關的時代要求，對促進中國海洋養殖及其產品的貿易有重要作用。

重組酶介導擴增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技術也是一種在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。與RPA不同的是，RAA擴增法使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，反應產物也是以指數級增長，通常在1h內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。在RAA反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監控整個RAA擴增過程，20分鐘內，可實現對起始模板的定量及定性分析。整個反應簡單快速，因為不需要高溫循環，所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用，適用于食品快速檢測領域。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供鮭魚甲病毒(SAV)的RAA恒溫熒光核酸檢測試劑盒及檢測方法。

為實現以上目的，本發明采用以下技術方案：