[發明專利]一種豬腸道隱窩分離和3D類器官培養的方法

在審

• 申請號: 201811066368.2
• 申請日: 2018-09-13
• 公開（公告）號: CN109161516A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 肖少波;方六榮;馬盼盼;王蕩;劉康;馬俊
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

本發明屬于動物組織分離和培養技術領域。具體涉及一種豬腸道隱窩分離和3D類器官培養的方法。本發明在豬腸道隱窩分離的過程中加入青霉素和鏈霉素，避免了后期培養過程中由腸道微生物導致的污染，通過優化水平搖轉儀處理腸段的轉速和時間及渦旋儀渦旋的次數和時間，使獲得的隱窩形態更完整，存活率和出芽率更高。本發明優化了用于隱窩和3D類器官培養的培養液的配方，使隱窩能更好地分化形成3D類器官并穩定地生長和分化。本發明確定了豬腸道隱窩的分離條件和最佳培養方法，為后續利用豬腸道3D類器官研究腸道病毒和細菌感染奠定了良好的基礎。

技術領域

本發明屬于動物組織學技術領域。具體涉及一種豬腸道隱窩分離的方法和3D類器官的培養方法。

背景技術

傳統用于腸道生理和病理過程研究的二維(2D)細胞系由單一種類細胞組成，而腸道各部分有其獨特的組織結構和生理功能，2D細胞系不能真實模擬腸道的結構、功能和發病過程，嚴重制約了腸道生理和病理過程的研究。近年來腸道3D類器官的發展為腸道及腸道疾病的相關研究提供了新的有用的工具。腸道3D類器官培養是在基質膠和多種生長因子存在的條件下在體外培養腸干細胞，使之逐漸增殖，分化出包括潘氏細胞、杯狀細胞在內的幾乎所有類型的腸上皮細胞，并形成具有多個隱窩區域的空腔樣結構(迷你腸)，同時保留腸干細胞自我更新和多向分化的能力(Stelzner M,et al.A nomenclature forintestinal in vitro cultures.American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology.2012,302(12):G1359-G1363.Mahe MM et al.Establishment ofhuman epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.Journalof visualized experiments.2015,97:e52438.)，因此3D類器官能真實地反映腸道的生理和病理過程。

目前人和小鼠的腸道3D類器官模型的研究已經比較成熟，人們能夠在體外穩定傳代培養人和小鼠的腸道3D類器官，且能長期凍存和復蘇(Sato T et al.Single Lgr5 stemcells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymalniche.Nature.2009,459：262-265.Sato T et al.Paneth cells constitute the nichefor Lgr5 stem cells in intestinal crypts.Nature.2011,469：415-418)，而且人和小鼠的腸道3D類器官已被廣泛應用于病毒和細菌的感染研究(Saxena K et al.Humanintestinal enteroids:a new model to study human rotavirus infection,hostrestriction,and pathophysiology.Journal of Virology.2016,90(1):43-56.Yin Y etal.Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primaryintestinal organoids.Antiviral Research.2015,123:120-131)。