[發(fā)明專利]基于焦磷酸測序技術的p15INK4b啟動子區(qū)甲基化程度定量檢測的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811064529.4 | 申請日： | 2018-09-12 |
| 公開（公告）號： | CN109182475A | 公開（公告）日： | 2019-01-11 |
| 發(fā)明（設計）人： | 黃映輝;馬羚 | 申請（專利權）人： | 黃映輝 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203 | 代理人： | 劉萍 |
| 地址： | 100124 北京*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 焦磷酸測序 啟動子區(qū) 甲基化 程度定量 試劑盒 引物 檢測 樣本 下游擴增引物 基因組DNA 安全穩(wěn)定 技術檢測 檢測引物 擴增檢測 抑癌基因 敏感度 | ||
1.用于檢測p15INK4b基因啟動子CpG島即CpG91甲基化的引物，其特征在于，所述中擴增引物其堿基序列為：
F：GGGGAGTTAGTAGGTAAAGAATTT
R：ACATTCCCAAAATATTAACCTTAACT
其中下游引物(R)5’端進行生物素標記
以及對擴增所獲得的核酸產物進行焦磷酸測序所需的測序引物，其堿基序列為：S：GTTTTTTTATTTTTTTAGGT。
2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，適用于以下擴增反應程序：
一、激活：95℃15min；
二、擴增：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共進行47個循環(huán)；
三、終延伸：72℃10min。
3.檢測p15INK4b基因啟動子CpG島(CpG91)甲基化的方法，其特征在于：
一、提取樣品基因組DNA；
二、對提純得到的基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，處理方式為將濃度為3M的180μl重亞硫酸鈉溶液與含有2μg DNA的20μl水溶液混合置于98℃，10min，然后64℃，2.5個小時；
三、對純化回收亞硫酸鹽處理得到的DNA進行擴增，所用引物如權利要求1所述，擴增程序如權利要求2所述；
四、取出5μl擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，根據(jù)產物條帶是否肉眼可見并且是否位于200與300bp的標記條帶之間來判斷擴增是否成功，并根據(jù)100bp標記條帶之下是否有條帶來判斷是否有引物二聚體；
五、對于擴增成功且無引物二聚體的樣品，將剩余擴增產物進行焦磷酸測序，所用測序引物如權利要求1所述；
六、根據(jù)實驗結束后PyroMark軟件輸出的報告獲得p15INK4b基因啟動子CpG島(CpG91)中所檢測的CG位點的甲基化程度。
4.一種包含用于檢測p15INK4b基因啟動子甲基化程度所需引物的試劑盒。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：還包括250units熱啟動聚合酶、200μl濃度為10mMdNTPs、2ml緩沖溶液、1.5mldd H2O、1ml濃度為15mM的MgCl2中的一種或多種。
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