[發(fā)明專利]一種檢測ATP7B基因突變的引物組合、檢測方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811063552.1
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN109055533B
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧國宏;譚文婷;但蕓婕;郭衍志
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市恒信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50102
• 代理人: 李金蓉

本發(fā)明公開了一種檢測ATP7B基因突變的引物組合、檢測方法及試劑盒，本試劑盒包含了特異性擴(kuò)增ATP7B基因靶向序列的25個引物對，其堿基序列為SEQ ID No.1～SEQ ID No.50，覆蓋ATP7B基因全部的21個外顯子和剪接區(qū)。利用該試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和常規(guī)測序，可用于快速檢測覆蓋ATP7B基因全部外顯子區(qū)和剪接區(qū)的已知突變和未知突變，該方法快速、準(zhǔn)確性高、價格便宜、操作簡單、普通實(shí)驗室即可開展。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測ATP7B基因突變的引物組合、檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)

ATP7B基因位于人類13號染色體長臂的1區(qū)4帶第3亞帶(13q14.3)，其GRCh38版本基因組坐標(biāo)為：Chr13:51,932,668-52,012,129，全長79461bp，包含21個外顯子和20個內(nèi)含子。ATP7B基因編碼一種銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶，參與人體內(nèi)銅離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。目前，國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為ATP7B基因是肝豆?fàn)詈俗冃缘闹虏』颍摶虮皇珍涍M(jìn)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫，收錄編號為OMIM*606882。ATP7B基因突變可導(dǎo)致ATP酶功能減弱或喪失，引起血清銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin)合成減少以及膽道排銅障礙，蓄積于體內(nèi)的銅離子在肝、腦、腎、角膜、腸道等處沉積，引起進(jìn)行性加重的肝硬化、錐體外系癥狀、精神癥狀、腎損害及角膜色素(Kayser-Fleischerring，K-F)環(huán)等典型的肝豆?fàn)詈俗冃园Y狀。

肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson病，是至今少數(shù)幾種可治的神經(jīng)遺傳病之一，關(guān)鍵是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，如不恰當(dāng)治療將會致殘甚至死亡。傳統(tǒng)的診斷肝豆?fàn)詈俗冃缘姆椒òㄑ邈~藍(lán)蛋白檢測、血清銅和尿銅的檢測、眼底K-F環(huán)以及肝臟功能的檢測等，但由于本病起病隱匿，受累器官多，首發(fā)癥狀不一，且早期癥狀不典型，早期診斷較為困難，極容易誤診和漏診，我們的研究結(jié)果顯示，肝豆?fàn)詈俗冃曰颊邚氖状伟l(fā)病至明確診斷中位病程為5個月，52.1％的患者在起病5個月之后才得以明確診斷，最長的起病82個月后才表現(xiàn)出典型的癥狀而得以確診。顯然，傳統(tǒng)的方法對于本疾病的早期識別能力有限。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)識到ATP7B基因突變檢測對早期識別肝豆?fàn)詈俗冃缘闹匾饬x，歐洲肝臟病學(xué)會發(fā)布的《Wilson病臨床診療指南》以及我國的《肝豆?fàn)詈俗冃缘脑\斷與治療指南》均推薦ATP7B基因突變檢測可用于肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩脑u估和患者家系成員的早期篩查。目前收錄在美國NCBI臨床疾病相關(guān)變異數(shù)據(jù)庫(ClinVar數(shù)據(jù)庫)的ATP7B基因致病的和可能致病的突變有172個，分布在1～21號外顯子以及部分內(nèi)含子的剪接區(qū)。另外，ATP7B基因突變具有明顯的人群異質(zhì)性和個體多樣性，文獻(xiàn)報道歐洲以His1069Gln為主(占35％～45％)、印度和中東分別以Cys271Stop(占20％)和Gln1399Arg(占30％)為主，而我國以Arg778Leu、Pro992Leu和Ala874Val為主(累計占27％～48％)。除了3個主要的突變，我們在我院的肝豆?fàn)詈俗冃曰颊咧袡z出Met769HisfsX26、Ile1148Th、Arg919Gly、Tyr715Stop等18個致病突變，其中13個為新發(fā)現(xiàn)的致病突變，并且文獻(xiàn)報道不斷有新的致病基因發(fā)現(xiàn)(LiX,et al.BMC Med Genet 2011,12:6)。因此，ATP7B基因突變的異質(zhì)性和個體差異性，決定了ATP7B基因突變檢測需要覆蓋本基因的所有外顯子及內(nèi)含子剪接區(qū)，才能準(zhǔn)確的、全覆蓋的識別ATP7B的致病突變。