[發明專利]循環腫瘤細胞的分離和培養方法

有效

• 申請號: 201811061720.3
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN109207428B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 華國強;張麗星;張登
• 申請（專利權）人: 上海易對醫生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種循環腫瘤細胞的分離和培養方法，其特征在于，包括：

采用Human CD45 Depletion Cocktail試劑盒除去抗凝外周血中的CD45陽性細胞，以便得到CD45陰性細胞液；

利用密度梯度離心法對所述CD45陰性細胞液進行處理，收集離心后的上層和中間層的細胞液；以及

對所述細胞液中的細胞進行培養；

所述培養所采用的培養基包括：

Wnt 3a蛋白、N-乙酰半胱氨酸、促胃液素、表皮細胞生長因子、R-spondin1蛋白、頭蛋白、成纖維細胞生長因子10、TGF-βRI、ALK4和/或ALK7抑制劑、抗菌劑、煙酰胺、DMEM培養基和F12培養基。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Wnt 3a蛋白的終濃度為80～200ng/mL，N-乙酰半胱氨酸的終濃度為0.5～2mM，促胃液素的終濃度為0.5～2nM，表皮細胞生長因子的終濃度為30～70ng/mL，R-spondin1蛋白的終濃度為300～800ng/mL，頭蛋白的終濃度為80～120ng/mL，成纖維細胞生長因子10的終濃度為5～15ng/mL，TGF-βRI、ALK4和/或ALK7抑制劑的終濃度為1～5μM，抗菌劑的終濃度為50～150μg/mL，煙酰胺的終濃度為5～20mM，DMEM培養基和F12培養基的體積比為1:1。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養基進一步包括：Rock抑制劑。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述Rock抑制劑的終濃度為5～10μmol/L。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養包括：

取所述細胞液中的細胞與液態Matrigel基質膠混合，并將所得到的混合液加入孔板中，預熱，以便使所述基質膠凝固；向所述凝固的基質膠中加入所述培養基，培養10～12天；或者

取所述細胞液中的細胞與所述培養基進行混合，并將所得到的培養液滴加至底部鋪有鼠尾來源膠原I的孔板中，培養10～12天。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述密度梯度離心法是采用下列方式進行的：

將所述CD45陰性細胞液與含有1～5％FBS的PBS緩沖液進行混合，得到混合液；

將所述混合液以(1～5):1的比例鋪在淋巴細胞分離液上，然后以1000～1500g的轉速離心8～15min，升降速分別為1和0。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述外周血取自患有癌癥的生物，所述癌癥包括胃癌、腸癌、肺癌、膽囊癌或胰腺癌。

8.一種篩選藥物的方法，其特征在于，包括：

將候選藥物與循環腫瘤細胞接觸；

測定所述接觸前后循環腫瘤細胞的生物活性，

與接觸前相比，接觸后所述循環腫瘤細胞的生物活性降低，是所述候選藥物作為目標藥物的指示，

其中，所述循環腫瘤細胞是利用權利要求1～7任一項所述循環腫瘤細胞的分離和培養方法所分離和培養得到的。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述藥物用于治療癌癥。

10.一種確定藥物有效性的方法，其特征在于，包括：

將藥物與循環腫瘤細胞接觸，所述藥物適用于使循環腫瘤細胞的生物活性降低；

測定所述接觸前后循環腫瘤細胞的生物活性，

與接觸前相比，接觸后所述循環腫瘤細胞的生物活性降低，是所述藥物有效的指示，

其中，所述循環腫瘤細胞是利用權利要求1～7任一項所述循環腫瘤細胞的分離和培養方法所分離和培養得到的。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述藥物用于治療癌癥。