[發(fā)明專利]一種皮膚組織的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811060758.9
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN109055303A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張輝;趙鴻;李濤;張玉光;王旭;左巖霞;張兆蕾;慈鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 山東麥德克斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 宋南

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種皮膚組織的構(gòu)建方法，包括以下步驟：成纖維細(xì)胞種在三維流式生物反應(yīng)器的支架內(nèi)，支架內(nèi)加入上述的優(yōu)化的Green培養(yǎng)液；在支架周圍加入RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)90?110h，在所述支架表面加入角質(zhì)形成細(xì)胞，培養(yǎng)；形成氣液交界面，定期更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)21±1天即可。本發(fā)明通過三維流式生物反應(yīng)器將成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共同立體培養(yǎng)，得到符合需求的皮膚組織，該組織可用于皮膚的移植。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種皮膚組織的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

皮膚是人體最大的器官。大面積皮膚缺失的主要原因是燒傷和燙傷。據(jù)1952年統(tǒng)計調(diào)查，在15-44歲人群中，當(dāng)體表總面積的60％以上皮膚損失，患者死亡率為100％(Bulland Fischer，1954)；但該死亡率在2003年降到41.4％(Chua et al 2003)。死亡率降低的主要原因是治療技術(shù)的提高。目前治療皮膚大面積缺失的治療主要是自體游離皮片移植和人工合成皮膚移植。

人工合成皮膚可以及時的救助患者，挽救生命。而組織工程皮膚細(xì)胞相容性高，具有更明顯的優(yōu)勢，也更適合患者。但價格昂貴是患者無法接受的，特別是在中國。每次大面積皮膚移植的(所需費(fèi)用在50萬美元以上)，限制了組織工程皮膚在國內(nèi)的開展與應(yīng)用。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種皮膚組織的構(gòu)建方法，能在較低價格的基礎(chǔ)上培養(yǎng)出面積較大的全層皮膚，該皮膚組織同時具有較好的生物相容性，滿足患者的需求。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種優(yōu)化的Green培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)基和Ham’s F12營養(yǎng)液按體積比為3±0.2：1組成的混合液中加入以下組分：以所述混合液的體積計，EGF 10±1ng/ml，氫化可的松0.4±0.05μg/ml，腺嘌呤0.18±0.02mM，胰島素5±0.5μg/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白5±0.5μg/ml，谷氨酰胺2±0.2mM，碘甲狀腺原氨酸0.2±0.05μM,FCS以及抗生素，所述FCS添加的體積百分?jǐn)?shù)為所述混合液體積的10％±1％。

本發(fā)明提供的優(yōu)化的Green培養(yǎng)液，涉及角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚組織的培育過程，為角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚組織的培育提供良好的基礎(chǔ)。

各組分的范圍均是可能在實驗過程中涉及的誤差范圍，因此，各組分在該范圍內(nèi)均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

Green培養(yǎng)液中添加抗生素主要是防止細(xì)菌對培養(yǎng)基的污染，根據(jù)所涉及的細(xì)菌可選用添加不同的抗生素。

進(jìn)一步地，所述抗生素包括兩性霉素B、青霉素、鏈霉素中的任一種或多種。

進(jìn)一步地，以所述混合液的體積計，各抗生素的添加量為：兩性霉素B0.625±0.05μg/ml，青霉素100±5U/ml，鏈霉素100±5μg/ml。

本發(fā)明還提供了一種角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

角化細(xì)胞重懸于上述的優(yōu)化的Green培養(yǎng)液中，加入輔助3T3細(xì)胞，培養(yǎng)；

7-8小時后更換KSFM培養(yǎng)基，加入EGF 10±1ng/ml；

每3天更換培養(yǎng)液，PBS清洗，培養(yǎng)得到所述角質(zhì)形成細(xì)胞。

KSFM培養(yǎng)基為(Keratinocyte Serum-free Growth medium的縮寫，是一種市售培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述角化細(xì)胞與所述3T3細(xì)胞的個數(shù)比例為1:0.8-1.2。

進(jìn)一步地，所述角化細(xì)胞由表皮組織消化分離得到。