[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的引物組合物，由其組成的試劑盒及試劑盒的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811059163.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109022596A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 成飛雪;劉勇;張德詠;何清聰;王劍;王東偉;宋志強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南省植物保護(hù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 湖南兆弘專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 43008
• 代理人: 陳暉

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的引物組合物，由其組成的試劑盒及試劑盒的應(yīng)用。其中，引物組合物包括正向外引物Mg?F3，反向外引物Mg?B3，正向內(nèi)引物Mg?FIP?Biotin，反向內(nèi)引物Mg?BIP和特異性探針Mg?HP?FITC。試劑盒包括上述引物組合物、dNTPs、DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液、檢測(cè)緩沖液和橫向流動(dòng)試紙條。試劑盒可應(yīng)用于水稻根以及水稻田土壤中擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的快速診斷和鑒別，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)以及基層農(nóng)技人員使用操作，對(duì)水稻根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的早期預(yù)警和防控具有極其重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的引物組合物，由其組成的試劑盒及試劑盒的應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)是水稻生產(chǎn)上的重要病原物，其中危害最為嚴(yán)重的是擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogynegraminicola）。該線(xiàn)蟲(chóng)是水稻上重要的內(nèi)寄生線(xiàn)蟲(chóng)，廣泛分布于南亞、東南亞、非洲、美洲和歐洲等國(guó)家的水稻產(chǎn)區(qū)，引起水稻根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病（Rice Root-KnotDisease），通常造成水稻減產(chǎn)11%至80%（Mantelin et al.，2017），甚至達(dá)100%，嚴(yán)重影響水稻的穩(wěn)定生產(chǎn)。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)耕作模式的改變，特別是直播水稻田面積的逐年增加，由擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)引起的水稻根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生危害也越來(lái)越嚴(yán)重。2016年至2018年，我國(guó)湖南、湖北、江西、江蘇、海南、廣西等多地水稻根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生嚴(yán)重，引起水稻大面積減產(chǎn)。擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)寄主范圍廣，危害隱蔽，防治極其困難。目前常用的低毒殺線(xiàn)蟲(chóng)劑大多用于旱地作物其他種類(lèi)線(xiàn)蟲(chóng)的防治，而直接用于水田根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害防控的安全有效、低成本的防治措施非常有限，特別是作物定植之后再進(jìn)行水稻根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害防治尤其困難。所以，開(kāi)展水稻根及其水田土壤樣品中擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病原快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定，對(duì)水稻根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的早期預(yù)警和實(shí)施有效的防控具有極其重要的意義。

目前，擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病原鑒定和檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定。雖然PCR方法在一定程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定上的缺陷，但需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)等較昂貴的儀器設(shè)備、較高的檢測(cè)費(fèi)用和較復(fù)雜的操作步驟。另外，這兩種方法，都需要將線(xiàn)蟲(chóng)從待檢測(cè)的土壤樣品中進(jìn)行分離和在顯微鏡下進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)觀(guān)察及挑取線(xiàn)蟲(chóng)等過(guò)程，既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又需要操作人員具備專(zhuān)業(yè)的技能和豐富的經(jīng)驗(yàn)，不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需要，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)以及基層普及應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等開(kāi)發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒溫60～65℃條件下保溫30～90 min，即可實(shí)現(xiàn)核酸的大量擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)可通過(guò)肉眼觀(guān)察反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色渾濁沉淀或是通過(guò)向其擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料等，利用顏色變化來(lái)直接判定結(jié)果。由于LAMP不需要專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備，在普通的水浴鍋或簡(jiǎn)單的恒溫器中即可完成，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、產(chǎn)物易檢測(cè)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等方面的檢測(cè)。但目前還沒(méi)有通過(guò)直接提取土壤中擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的DNA而快速檢測(cè)水稻田擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的LAMP方法。

雖然LAMP技術(shù)在檢測(cè)動(dòng)植物病原物上表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì)而被多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用，但是該技術(shù)在結(jié)果呈現(xiàn)方面仍然表現(xiàn)出一定不足和缺陷。其主要是利用焦磷酸鎂白色渾濁沉淀或是熒光染料顯色時(shí)有可能會(huì)因顯色不明顯而造成肉眼觀(guān)察不便捷或誤判等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的引物組合物，由其組成的試劑盒及試劑盒的應(yīng)用。試劑盒用于擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的LAMP-LFD檢測(cè)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可應(yīng)用于檢測(cè)擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，總DNA提取簡(jiǎn)便快速，直接提取土壤DNA進(jìn)行快速檢測(cè)，設(shè)備簡(jiǎn)單，耗時(shí)短。