[發明專利]TRV載體介導的病毒誘導基因沉默系統接種牡丹花器官的方法

在審

• 申請號: 201811057880.0
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109022483A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 張延龍;張慶雨;謝力行;孫道陽;牛立新;楊偉宗
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種TRV載體介導的病毒誘導基因沉默系統接種牡丹花器官的方法：將TRV病毒載體轉化農桿菌，對含有TRV的陽性克隆經培養后以注射接種方式侵染花器官。經本發明方法接種過的牡丹花器官，在花瓣、雄蕊、雌蕊、萼片等組織中均可以檢測到TRV病毒載體的存在，并出現TRV侵染的癥狀。本發明為病毒誘導基因沉默技術在牡丹花器官發育過程相關基因研究中的應用提供了一種快捷、高效的侵染方法。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及病毒誘導基因沉默中TRV載體侵染花器官的方法。

背景技術

牡丹(Paeonia suffruticosa)屬于芍藥科芍藥屬牡丹組，是重要的觀賞花卉和藥用植物，近年來，人們發現牡丹除了其花大色艷的觀賞特性，也是一種優良的油料作物，其籽油具有產油量高、油用品質好的特點。然而，牡丹作為木本植物，其遺傳轉化體系尚不成熟，且牡丹生長年限長，從實生苗到開花需要3～4年的時間，研究牡丹花發育以及果實發育相關的基因存在極大的瓶頸。

病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一種轉錄后的基因沉默技術，其作為一種有效的反向遺傳學技術已經被廣泛的應用于多種植物。VIGS的作用原理是植物在抵御病毒侵染的過程中會產生特異性核酸內切酶Dicer，將病毒復制過程中產生的雙鏈RNA切割成21～24個核苷酸的小分子干擾RNA(siRNA)。siRNA在植物細胞內進一步擴增后，以單鏈形式與Agronaute 1(AGO1)蛋白等結合，形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC能夠特異地引起植物細胞質中與siRNA同源的mRNA的降解，從而導致目的基因的沉默。

VIGS技術主要借助病毒載體來實現對內源基因的沉默。煙草脆裂病毒(Tobaccorattle virus,TRV)是一類應用比較廣泛的病毒載體，具有寄主范圍廣、沉默效率高、維持時間長等優點。VIGS實驗常用沉默載體為煙草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的雙元表達載體TRV1和TRV2(Wang S B,Tian S L,Shah S N,et al.Cloning andcharacterization of the CarbcL gene related to chlorophyll in pepper(Capsicumannuum L.)under fruit shade stress.Frontiers in Plant Science,2015,6(6):850.)。TRV1包括編碼RNA依賴的RNA聚合酶、運動蛋白和16kD蛋白的基因，是VIGS體系的輔助病毒載體。TRV2包括衣殼蛋白(Cp)基因、多克隆位點(MCS)等，用于插入目的基因。

但牡丹作為木本植物，突變體不易獲得，給這類植物的分子育種帶來了諸多不便。目前有關VIGS在牡丹花發育過程中的應用并沒有相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種TRV載體介導的病毒誘導基因沉默系統接種牡丹花器官的方法，該方法可以簡單、高效、低成本的使TRV病毒載體浸染發育中的牡丹花器官。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

1)將病毒載體TRV1以及TRV2或者將病毒載體TRV1以及插入有目的基因的重組TRV2分別轉化農桿菌，將轉化得到的含有TRV1的陽性農桿菌與含有TRV2或重組TRV2的陽性農桿菌經培養后于侵染緩沖液中混合，得混合菌液；

2)經過步驟1)后，用帶針頭的注射器吸取混合菌液，然后將針頭于發育中的牡丹花器官處插入牡丹植株內部并進行注射接種，直至該牡丹花器官表面有液體滲出(水漬狀)時停止注射；

3)注射結束后采用以下條件對牡丹植株進行培養：溫度為21～25℃，濕度為60～70％，光照強度為1800～2000Lx，16h光照/8h黑暗。