[發明專利]三重qPCR檢測DNA甲基化的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201811056731.2
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109112216B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 韓艷;霍華德·霍約恩·章;余濤;萬季;宋麒
• 申請（專利權）人: 深圳市新合生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京金信知識產權代理有限公司 11225
• 代理人: 張皓;徐琳

本公開提供了三重qPCR檢測DNA甲基化的試劑盒和方法。所述試劑盒包含三組引物和探針的組合，其中兩組引物和探針的組合是以選自人類SEPT9基因序列范圍內的兩個區域為靶點設計的引物和探針的組合，另一組引物和探針的組合是以內部參照基因為靶點設計的引物和探針的組合。所述試劑盒能夠更敏感和準確地確定特定區域DNA甲基化水平或狀態。

技術領域

本公開屬于醫藥生物領域，具體而言，主要涉及DNA甲基化檢測試劑盒和方法，特別是人的液體活組織檢查中與大腸癌相關的目標基因Septin9(SEPT9)的DNA甲基化檢測方法以及用于檢測目標基因SEPT9的DNA甲基化的試劑盒。

背景技術

大腸癌(CRC)是全世界第三大常見癌癥，每年有600,000人死亡。對于CRC，早期識別和早期干預是降低死亡率的最佳方法。目前的篩查方法是結腸鏡檢查和大便隱血和免疫組織化學檢測(gFOBT/FIT)。由于結腸鏡檢查的不適以及對腸道制品的厭惡，這些篩查方法并未充分使用。因此，使用可靠的非侵入性血液基礎檢測來評估CRC風險對于早期發現CRC可能是有價值的。

DNA甲基化改變是癌癥中最早的分子變化之一。腫瘤抑制基因的高甲基化已被確定為抑制基因表達并促進癌細胞生長和擴張的機制。

在CRC中，SEPT9，SFRP2，TFPI2，NDRG4，BMP3和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接續鳥苷(G))的超甲基化已被認為是癌癥的生物標記之一。因此，一個或多個這些基因的甲基化狀態分析，可用于輔助診斷大腸癌的狀態。

目前用于診斷及檢測結果的困難度來自于組織活檢的侵入性。液體活檢可解決這個問題，其中用于分析的生物樣本，可從血液，尿液，唾液，痰液或組織樣本等獲得。

傳統的診斷癌癥方法相比，液體活檢有一些主要的優勢：

1.易取得，液體活檢也可從尿液，唾液和胸腔積液獲得；

2.比傳統的腫瘤活組織檢查更少侵入性；

3.能取樣所有可能的癌細胞，而不非僅局限于腫瘤活檢的某部分；

4.允許早期發現癌癥；

5.能用于監測腫瘤動態(治療前，治療間和治療后)；

6.具有能作為理想識別標靶治療因子的潛力。

人類生物樣本包含，源自所有組織(包括癌癥組織)的細胞、蛋白質、外來體和游離DNA(cfDNA)、游離RNA(cfRNA)。游離DNA的濃度非常低，在血漿約至1-10ng/mL。腫瘤突變DNA可以在來自癌癥患者的生物樣本的cfDNA中檢測到，被稱為循環腫瘤DNA(circulatingtumor DNA,即ctDNA)。這些ctDNA為大約134-144bp的DNA片段，而其濃度更可小于cfDNA。

臨床上使用ctDNA輔助癌癥診斷和療法選擇的主要挑戰，仍在于開發靈敏的檢測方法在高cfDNA背景水平中區分微弱的ctDNA信號，特別是對于ctDNA濃度可能至pg/mL程度的早期診斷。此外，目前可用的檢測試劑盒受到DNA提取方法不佳、亞硫酸氫鹽處理量差或用于檢測甲基化DNA的設計不佳的定量PCR方法的限制。