[發明專利]一種編碼裙帶菜ζ-胡蘿卜素脫氫酶的基因與應用

有效

• 申請號: 201811056037.0
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109055409B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 李榮貴;馬怡;杜桂彩;張廷婷
• 申請（專利權）人: 青島大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 青島高曉專利事務所(普通合伙) 37104
• 代理人: 張世功

本發明涉及一種編碼裙帶菜ζ?胡蘿卜素脫氫酶的cDNA序列及其氨基酸序列與應用。裙帶菜ζ?胡蘿卜素脫氫酶基因的全長cDNA序列通過快速擴增cDNA末端途徑從裙帶菜中分離得到并命名為UPZDS，全長cDNA序列為2804bp，含有1821bp的開放閱讀框ORF，編碼606個氨基酸，其分子量為65.82717kDa。該裙帶菜ζ?胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)基因的克隆為研究巖藻黃素在褐藻中的生物合成途徑奠定了基礎，對于褐藻中類胡蘿卜素的醫藥保健以及工業化生產具有重要意義。

技術領域：

本發明涉及一種編碼裙帶菜-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)基因的克隆和功能驗證，尤其是涉及一種編碼裙帶菜-胡蘿卜素脫氫酶的cDNA序列及其氨基酸序列與應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

類胡蘿卜素分為兩類：一類是不含氧的烴類，即胡蘿卜素；另一類是胡蘿卜素的含氧衍生物，即葉黃素類。巖藻黃素又稱為褐藻黃素，屬于類胡蘿卜素中葉黃素類，是一類脂溶性色素，廣泛分布于褐藻門、硅藻綱。在紅藻和綠藻中類胡蘿卜素的生物合成途徑已經有完整的說明，相反，在褐藻中，類胡蘿卜素的生物合成途徑尚不完全清楚。因此，研究裙帶菜中類胡蘿卜素生物合成途徑中涉及到的關鍵酶的基因，并對其進行克隆及其功能的研究，有助于了解褐藻屬植物類胡蘿卜素生物合成及其分子水平的調控，對于褐藻中類胡蘿卜素的醫藥保健以及工業化生產具有重要意義。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種編碼裙帶菜-胡蘿卜素脫氫酶的cDNA序列及其氨基酸序列與應用。

為了實現上述發明目的，本發明的一種編碼裙帶菜-胡蘿卜素脫氫酶的cDNA序列及其氨基酸序列按照以下方法操作：

一、裙帶菜-carotene desaturase基因cDNA部分序列克隆

cDNA合成采用反轉錄試劑盒(PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA SynthesisKit，TaKaRa)，并按照反轉錄試劑盒說明書進行，以適量總RNA為模板，以Oligo(dT)為引物，在PrimeScript II RTase逆轉錄酶的作用下，42℃溫育1h，合成cDNA第一鏈，-20℃保存；

根據已知的裙帶菜近緣藻類的ZDS序列資料及裙帶菜轉錄組測序數據，設計一對引物(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；

正向引物ZDS-P1：5’-TGACTTTGTCGCCCCCTCCATGG-3’；

反向引物ZDS-P2：5’-AAGGACGGGAACCACATCGAGATGG-3’。

以cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR程序：94℃預變性3min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min10s，30個循環，72℃延伸10min；得到的PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用膠回收試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)回收目的DNA，并將其連接到pMD-18TVector上，構建pMD-18T-ZDS，將連接PCR產物的載體轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆并測序；

二、裙帶菜-carotene desaturase基因3’端cDNA序列克隆

3’端cDNA序列克隆采用3’-RACE方法，試劑盒為RACE 5’/3’Kit UserManual(TaKaRa公司產品)，并按照3’-RACE試劑盒說明書進行。根據裙帶菜ZDS大片段cDNA序列設計克隆3’端cDNA序列所需的下列引物(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；

正向引物3’GSP1：5’-GGACTACTACAAACCCGGGGAGGGCTCC-3’；

正向引物3’GSP2：5’-CGTGGTGAAGGTCGGTCAGTCGCTCTAC-3’。