[發(fā)明專利]多重檢測EGFR基因19外顯子多種熱點突變試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811055079.2
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109112189A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設計）人: 王建平;鄒秉杰;潘騰飛
• 申請（專利權）人: 廣州市寶創(chuàng)生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 曾銀鳳

本申請公開了一種多重檢測EGFR基因19外顯子多種熱點突變試劑盒，其包括有針對EGFR基因19外顯子上多種熱點突變的引物和探針，所述探針為SEQ ID NO.3以及選自SEQ ID NO.4?SEQ ID NO.23中的至少一種，或為上述探針序列的反向互補序列；所述引物包括內(nèi)標引物與待檢突變引物，內(nèi)標引物與待檢突變引物相同，且內(nèi)標探針設計在EGFR基因野生型序列的同一待檢區(qū)域。本發(fā)明將引物和輔助探針設計為共用序列，不僅能夠減少19del檢測體系設計的難度，還可以降低后期反應體系優(yōu)化和引物探針相互影響的缺陷，增加本方法的實用性，且降低檢測試劑成本。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物技術和基因檢測領域，具體是涉及一種新型單管高靈敏的多重檢測EGFR基因19號外顯子多型別突變位點的試劑盒。

背景技術

EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域激活與癌細胞增殖、轉移和凋亡等多種信號傳導通路有關。肺腺癌患者EGFR基因敏感突變亞裔人群陽性率要高于高加索人群。EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶(TK)區(qū)域的前四個外顯子上(18～21)，目前發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30多種。缺失突變主要發(fā)生在外顯子19上，最常見的是del E746-A750，且突變種類多，常見的缺失突變達到19種左右，因此檢測難度很大，目前主要是基于ARMS-PCR或數(shù)字化 PCR等建立的檢測方法，該類方法整個設計和優(yōu)化過程繁瑣，成本高昂，需要一種更為簡單有效的能夠?qū)崿F(xiàn)EGFR基因19號外顯子多型別突變位點并列檢測方式。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的之一為提供一種簡單、靈活、靈敏且可定量的多重檢測EGFR基因19外顯子多種熱點突變試劑盒，解決EGFR基因19外顯子多種熱點突變單管多重檢測的難題。

實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。

一種多重檢測EGFR基因19外顯子多種熱點突變試劑盒，包括有針對EGFR 基因19外顯子上多種熱點突變的引物和探針所述探針為SEQ ID NO.3以及選自SEQ ID NO.4—SEQID NO.23中的至少一種，或為上述探針序列的反向互補序列所述引物包括內(nèi)標引物與待檢突變引物，內(nèi)標引物與待檢突變引物相同，且內(nèi)標探針設計在EGFR基因野生型序列的同一待檢區(qū)域。

在其中一個實施例中，所述引物為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

探針SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.23中的任意一種或幾種探針均可分別與本試劑盒中的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及探針SEQ ID NO.3檢測對應的 EGFR基因19外顯子上的熱點突變。

本發(fā)明的另一目的是提供一種多重檢測EGFR基因19外顯子多種熱點的探針。

一種多重檢測EGFR基因19外顯子多種熱點的探針，所述探針為SEQ ID NO.3以及選自SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.23中的至少一種，或為上述探針序列的反向互補序列。。

本發(fā)明充分發(fā)揮了PCR擴增技術和核酸侵入反應技術優(yōu)勢，且進一步發(fā)展了多重核酸侵入反應技術，具體原理是：通過設計一對PCR引物對EGFR基因19外顯子多種熱點突變目標區(qū)域進行擴增，用以擴增待檢靶區(qū)域。針對19 外顯子多種熱點突變較集中的特點，針對性的設計一條共用輔助探針，并分別設計針對每一種熱點突變的檢測探針，并標記熒光集團和淬滅基團。反應中，輔助探針、檢測探針能夠與擴增靶標模板退火雜交，形成一個單堿基重疊侵入結構，該結構可被Afu酶特異性識別，從而切割檢測探針與模板互補的第一堿基的化學鍵，產(chǎn)生信號分子。由于設計的檢測探針與模板結合部分的Tm值接近反應溫度，新的完整的檢測探針會再次與模板退火，形成新一輪的切割，從而實現(xiàn)信號分子的擴增，如此實現(xiàn)對目標物的檢測。

本發(fā)明具有以下有益效果：