[發明專利]一種基于LBL法修飾肝素分離細胞外囊泡的方法

在審

• 申請號: 201811054860.8
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109136164A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 張群;雷豪志;王煜蘅
• 申請（專利權）人: 上海浦美醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

本發明公開了一種基于LBL法修飾肝素分離細胞外囊泡的方法。其具體步驟如下：(1)首先通過LBL層層修飾的方法，以靜電吸附的原理，在若干帶正電的納米球上逐層交替修飾肝素和聚二烯丙基二甲基氯化銨PDADMAC；修飾層從內到外按照肝素、PDADMAC、肝素的順序進行排列，修飾層的層數為大于等于三層的奇數層；(2)將修飾后的納米球加入到含有細胞外囊泡的體液中反應5min?120min后，離心或者磁吸附收集納米球；(3)在收集的納米球中加入氯化鈉溶液反應，吸附在納米球表面的細胞外囊泡洗脫到氯化鈉溶液中，實現體液中細胞外囊泡的分離。本發明方法簡單可靠、成本極低、靈活度大。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種基于LBL法修飾肝素分離細胞外囊泡的方法。

背景技術

細胞外囊泡通常包括外泌體、微囊泡和凋亡小體等，攜帶各種蛋白、核酸，甚至全基因組的DNA，可作為信使，通過血液、尿液、乳汁、唾液等途徑介導細胞間的信號的傳導。研究表明，細胞外囊泡介導了腫瘤的發生、發展以及轉移，能夠反映腫瘤的相關信息，是一種潛在的腫瘤分子標志物。細胞外囊泡的分離純化是外泌體研究與應用的主要瓶頸。目前的提取方法包括：基于密度的超速離心法、基于尺寸的過濾分離法、基于抗體的免疫富集法、基于類似分離病毒的PEG沉淀法等。對于超速離心法來說，設備及耗材昂貴，耗時較長，純度低。過濾分離法極易造成阻塞，材料消耗較大，耗時較長。免疫富集法可得到高純度細胞外囊泡，但抗體制備復雜，價格昂貴，批次間不穩定。PEG沉淀法可以低成本快速的分離得到細胞外囊泡，但純度低，蛋白質污染嚴重。

2015年研究人員發現，通過共價修飾方法制備的帶有肝素的瓊脂糖凝膠納米球可以特異的結合細胞外囊泡，并且可以通過高濃度氯化鈉溶液將結合的細胞外囊泡洗脫下來，從而獲得純度較高的細胞外囊泡。這種分離富集細胞外囊泡的方法成本低，速度快，為細胞外囊泡的研究和應用提供了有力支持。但是這種方法也存在一定的問題，首先瓊脂糖凝膠納米球本身為多孔材料，吸附細胞外囊泡的同時也會吸附一定量的核酸或者蛋白質等雜質，洗脫時雜質也會一同洗脫下來，影響純度。其次，肝素是通過共價鍵方式修飾在瓊脂糖凝膠納米球上，修飾需要一定的化學反應，增加了分離成本。

層層自組裝LBL修飾的方法，是兩種帶相反電性質或相反親疏水性質的大分子物質，通過layer-by-layer的方法，將大分子物質一層一層的修飾到基底上，從而實現大分子對表面的修飾。可以低成本、快速的對表面進行特定分子的修飾，在表面獲得想要的性質。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于LBL法修飾肝素分離細胞外囊泡的方法。本發明分離細胞外囊泡的方法簡單可靠、成本極低、靈活度大、分離速度快，分離效果好。

本發明的技術方案具體介紹如下。

一種基于LBL法修飾肝素分離細胞外囊泡的方法，具體步驟如下：

(1)首先通過LBL層層修飾的方法，以靜電吸附的原理，在若干帶正電的納米球上逐層交替修飾肝素和聚二烯丙基二甲基氯化銨PDADMAC；修飾層從內到外按照肝素、PDADMAC、肝素的順序進行排列，修飾層的層數為大于等于三層的奇數層；

(2)將修飾后的納米球加入到含有細胞外囊泡的體液中反應5min-120min后，離心或者磁吸附收集納米球；

(3)在收集的納米球中加入2.0～2.5mol/L氯化鈉溶液反應10～20min，吸附在納米球表面的細胞外囊泡洗脫到氯化鈉溶液中，通過離心或者磁吸附棄去納米球，實現體液中細胞外囊泡的分離。

本發明中，步驟(1)中，帶正電的納米球是由聚苯乙烯、四氧化三鐵、硅或二氧化硅材質的納米球經過氨基化或者硅烷化處理獲得。

本發明中，步驟(1)中，帶正電的納米球的個數為5萬-100萬個，其粒徑在50納米～10微米之間。