[發明專利]識別增強型亞穩態核酸適配體探針及在目標物質計數分析中的應用

有效

• 申請號: 201811052993.1
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109385426B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 鄧銳杰;夏許寒;何強
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/6851
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司 51202
• 代理人: 黃幼陵

本發明所述識別增強型亞穩態核酸適配體探針，熔煉溫度Tm低于45℃，為末端互補的發卡形結構；當有目標物質存在時，該核酸適配體探針能夠與目標物質結合，并進而打開其末端莖部，通過聚合酶的作用引發滾環擴增反應，當無目標物質存在時，該核酸適配體探針形成閉合結構，并可通過延長末端莖部使其雙鏈結構更穩定，不能在聚合酶的作用下引發滾環擴增反應。優選的識別增強型亞穩態核酸適配體探針，核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所述。該識別增強型亞穩態核酸適配體探針在目標物質計數分析中應用，可提升對目標分子的響應靈敏性和識別效率，回收率達88～110％。

技術領域

本發明屬于核酸適配體探針技術領域，特別涉及識別增強型亞穩態核酸適配體探針及其在目標物質計數分析中的應用。

背景技術

核酸適配體是一類具有分子識別性的功能核酸，是能夠與靶分子高親和力和高特異性結合的單鏈DNA或RNA。相比抗體，核酸適配體具有結構響應性、穩定和廉價等優勢，它可以通過不依賴靶標分子抗原性的體外篩選過程高效獲取，因此特別適用于構建只有低抗原性的小分子的高效識別元件。

然而核酸適配體和目標分子的結合效率是需要解決的關鍵問題，由于現有技術公開的核酸適配體探針難以既保持自身核酸結構的穩定性(雙鏈雜交的解離常數Kd值＜10^-9M)，又對弱結合力的目標分子的結合作用進行有效響應(適配體與目標分子作用的解離常數Kd值一般在10^-5-10^-9M之間)，因此會導致核酸適配體探針對目標分子的識別效率低，只有高濃度的目標分子才能產生檢測信號。為了提高核酸適配體探針對目標分子的響應性和識別效率，提升基于核酸適配體的傳感分析方法的靈敏度和準確定量性，勢必需要設計和合成新的核酸適配體探針。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術的不足，提供識別增強型亞穩態核酸適配體探針，以提高對目標分子的響應性和識別效率。本發明的再一目的是提供識別增強型亞穩態核酸適配體探針在目標物質計數分析中的應用，以提升基于核酸適配體的傳感分析方法的靈敏度和準確定量性。

本發明所述識別增強型亞穩態核酸適配體探針，其熔煉溫度Tm低于45℃，為末端互補的發卡形結構，包括雙鏈的莖部和單鏈的環部，所述莖部互補堿基小于5個；當有目標物質存在時，該核酸適配體探針能夠與目標物質結合，并進而打開其末端莖部，通過phi 29DNA聚合酶的作用引發滾環擴增反應，當無目標物質存在時，該核酸適配體探針形成閉合結構，并可通過延長末端莖部使其雙鏈結構更穩定，不能在phi 29 DNA聚合酶的作用下引發滾環擴增反應，從而降低背景信號。

本發明所述識別增強型亞穩態核酸適配體探針，優選下述三種：

第一種識別增強型亞穩態核酸適配體探針，核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：1所述，其可結合的目標物質為赭曲霉毒素A，命名為RMSApt-OTA。

第二種識別增強型亞穩態核酸適配體探針，核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：2所述，其可結合的目標物質為卡那霉素，命名為RMSApt-Kana。

第三種識別增強型亞穩態核酸適配體探針，核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：3所述，其可結合的目標物質為L-酪氨酸胺，命名為RMSApt-L-Tyrosinamide。

本發明通過實驗證明，上述識別增強型亞穩態核酸適配體探針可在目標物質計數分析中應用，實現適配體與目標分子作用解離常數Kd值在10^-5-10^-9M之間的目標分子高靈敏檢測。

本發明所述識別增強型亞穩態核酸適配體探針在目標物質計數分析中的應用，步驟如下：

(1)制備用于滾環擴增的環形探針