[發明專利]產生牛妊娠相關糖蛋白特異性單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株、單克隆抗體、試劑盒及檢測

有效

• 申請號: 201811051878.2
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109295003B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 王會巖;蔡建輝;胡川閩;徐淞;孫美艷;劉靜;李艷
• 申請（專利權）人: 吉林醫藥學院;重慶探生科技有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;G01N33/573;C12R1/91
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務所(普通合伙) 13113
• 代理人: 張紅衛

本發明涉及產生牛妊娠相關糖蛋白特異性單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株、單克隆抗體、試劑盒及檢測，該細胞株為兩株能產生牛PAG特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏編號分別為CCTCC NO：C2018170、CCTCC NO：C2018171，它們能產生特異性單克隆抗體H4和G7；所述試劑盒包含單克隆抗體H4和G7并以H4作為捕獲抗體、以G7作為檢測抗體，用于檢測牛PAG，能與奶牛體內的天然PAG具有較好的識別能力和結合能力。本發明通過并通過建立標準的雙抗體夾心ELISA體系，能夠準確檢測標本中的牛PAG，并以此成功建立了檢測牛PAG的雙抗體夾心ELISA方法，適用于牛PAG免疫檢測。

技術領域

本發明涉及生物醫藥工程技術領域，并且更具體地，涉及到產生牛PAG特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，特異性單克隆抗體，檢測牛PAG的試劑盒及其檢測方法。

背景技術

早期妊娠判斷是保證和提高奶牛繁殖率和產奶量的關鍵環節之一。在奶牛配種或人工受精后，都需要及時進行早期妊娠判斷。空懷牛發現越早，就能越早進行第二次發情管理和配種，縮短配種間隔，從而提高妊娠率，避免或減少母牛早期妊娠缺失造成的各種損失。因此牛的早期妊娠診斷一直是畜牧業發展中值得高度關注的重要問題。

傳統的牛早孕判斷主要包括三種方法：直腸觸診法、超聲波診斷法、血液或牛奶中孕酮檢測法。直腸觸診法成本低，能馬上得到結果，如果操作者的經驗和水平高，該法的準確率可達95％以上，通常在配種后35～65天由獸醫來進行首次檢查，并在較多時候被作為診斷妊娠的標準。但是該方法對操作人員或者牧場獸醫有較高技術要求，一般飼養人員難以掌握，而且該操作對早期胚胎具有一定的侵害性，有結果表明該操作與胚胎死亡之間存在明確的相關性。超聲波診斷法與直腸觸診法相比危害較小，操作簡便，準確率高。有研究資料表明在配種后21～25天檢測，妊娠的敏感性和特異性分別是44.8％和82.3％；如果在配種后26～33天檢測，其敏感性和特異性可分別提高至97.7％和87.7％。但由于B超儀器價格較高，體積較大使其難以在生產實踐中廣泛應用。基于放射免疫原理檢測奶牛血液或牛奶中孕酮也可用于早期妊娠的判斷，最佳的孕酮檢測時間是配種后24天， 因為這時候進行檢測能在一定程度上消除長發情間隔造成的假陽性，現場檢測牛奶中的孕酮敏感性約為93.1％，但是其特異性只有39.3％，意味著這種情況下可能會將大量非孕牛誤判為妊娠牛，造成損失。同時該方法涉及到的放射性污染等問題也為其大量推廣應用帶來了較大程度的限制。目前市場上有售的膠體金試紙條檢測奶牛乳汁中孕酮來判斷奶牛妊娠，與實際情況具有較好的符合率，但其判斷標準很難確定，而且影響因素較多，因此通過檢測孕酮判斷妊娠的方法在國內仍未得到廣泛的推廣應用。

研究表明，奶牛妊娠后，胎盤滋養層雙核細胞在與母體子宮上皮細胞融合時，會分泌釋放出多種特征性的蛋白，部分蛋白可以作為牛早期妊娠的生物標志物，其中研究最為深入并被廣泛認可的是妊娠相關糖蛋白（pregnancy associated glycoproteins，PAG）。PAG蛋白和胃蛋白酶、組織蛋白酶D等屬于天冬氨酸脫氫酶家族，目前已知的PAG蛋白有22種。多項研究表明：奶牛體內PAG濃度從妊娠開始后緩慢上升，配種1個月后妊娠奶牛與非妊娠奶牛PAG濃度出現顯著差別，奶牛妊娠的2～3月PAG濃度出現上升和下降的波動，不過其平均濃度仍在不斷上升；奶牛妊娠的4～7月PAG濃度出現較快上升趨勢；在分娩前PAG濃度達到最大值。這些結果為通過測定PAG濃度水平來判斷奶牛妊娠提供了理論依據。

事實上，有文獻表明，基于PAG特異性抗體建立的放射免疫分析法，對配種后35天的奶牛妊娠確診率為93.03%，空懷率確認為97.90%，表明PAG完全可以作為牛妊娠診斷檢測的標志物。隨著技術的發展，以PAG為檢測目標的檢測方法越來越多，如美國IDEXXLaboratories等公司生產的牛懷孕檢測試劑盒，基于固相酶聯免疫吸附試驗，可用于檢測牛血清或EDTA抗凝牛血漿中PAG的檢測。