[發明專利]臍帶間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的方法

在審

• 申請號: 201811051310.0
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN110885787A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 安勝軍;張君;趙瑩茜
• 申請（專利權）人: 安勝軍
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種臍帶間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的方法，屬于生物醫學技術領域，所述方法包括預誘導分化步驟，所述預誘導分化步驟包括以下操作，將間充質干細胞按1～5×10⁴個/ml的細胞密度接種，待間充質干細胞貼壁后，于低氧環境下用含黃酮類誘導物的預誘導培養液培養2～3天；其中，黃酮類誘導物在誘導液中的濃度為8?12ng/ml。采用本發明獲得的臍帶間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的方法可將臍帶間充質干細胞定向分化為多巴胺能神經元，且分化效率高，誘導時間短，同時操作簡單、方便。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，尤其涉及一種臍帶間充質干細胞向多巴胺能神經元分化的方法。

背景技術

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見于老年人的神經系統退行性疾病，其發病率僅次于阿爾茲海默病，位于第二位，一直是臨床治療的難點。目前認為其主要是因為腦中多巴胺能神經元的退行性變，大腦的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的藥物和手術療法能緩解疾病的早期臨床癥狀，但無法阻止或逆轉多巴胺能神經元退行性變，而且長期使用有明顯的副作用。且隨著我國人口平均壽命延長和社會老齡化進程加速，帕金森病的發病率呈明顯上升趨勢，已成為一個嚴重的社會問題，帕金森病主要的病理生化改變是位于中腦黑質致密區的多巴胺能神經元漸進性變性壞死，致使黑質-紋狀體通路多巴胺神經遞質水平下降，引起錐體外系的功能失調，從而導致以隨意運動減慢、肌張力僵直、肢體震顫和正常的姿勢平衡反射喪失為主的臨床癥狀。長期以來，人們一直在尋找能夠有效治療帕金森病的方法，由于本病主要是源于多巴胺能神經元變性死亡而致，若能將合成和分泌多巴胺的細胞移植入黑質-紋狀體系統，理論上講是最為理想的治療措施，可以起到治愈該病的作用。但這種療法卻存在難以克服的困難，主要限制因素是無法同時獲得足夠用于移植的胚胎組織，所以，尋找新的細胞來源已成為細胞替代治療首要解決的問題。

自2000年的Erices等報道臍帶血中含有豐富的造血干細胞和間充質干細胞以來，因臍帶血間充質干細胞的多向分化潛能，免疫調節作用和無倫理問題等優點，備受研究者的關注。隨后，有學者分別報道了臍帶血間充質干細胞在體外可誘導表達神經元標志物和神經膠質細胞標志物。目前，人們已經可以成功的體外分離培養臍帶血間充質干細胞，且對其生物學特性、表面標志和免疫原性有了進一步的了解。近年來成功地誘導臍帶血間充質干細胞分化為骨、脂肪、軟骨、肝臟及神經等成體細胞，展示了臍帶血間充質干細胞的無限分化潛能和廣闊的應用前景，從而為體外誘導臍帶血間充質干細胞分化各種成體細胞和各種疾病的治療提供了新的思路。

臍帶間充質干細胞(MSC)是中胚層起源的，能夠進行自我更新，并具備向成骨、軟骨和脂肪三種中胚層系細胞分化潛能的一種成體干細胞。近年來研究發現，MSC在中胚層之外，還可以跨胚層進行轉分化，如分化成外胚層系的神經細胞和上皮細胞以及內胚層系的肝細胞和胰腺細胞。因為MSC來源廣泛，易于分離培養，免疫原性較低，且不存在胚胎干細胞所面臨的倫理學問題，這使其在再生醫學方面的應用具備了其他干細胞所沒有的優勢。中樞神經系統的神經退行性疾病如帕金森氏綜合征以及外部創傷造成的神經損傷等長期困擾人類的問題也因此將有更為現實可行的解決之道。

目前體外誘導的方法主要分為3種：①神經營養因子和細胞因子，如維甲酸、腦源性神經營養因子、成纖維細胞生長因子等誘導分化。②化學試劑，如二甲基亞砜、2-巰基乙醇、丁羥茴醚等誘導分化。③基因轉染或修飾的誘導分化。全骨髓培養得到的MSCs在體外合適條件和誘導因子作用12天可分化為表達多巴胺神經元標志物酪氨酸羥化酶(TH)的神經元樣細胞，并具有一定的電生理活性，分化效率可達67％，是目前骨髓間充質干細胞能達到的最大分化率以及最短的誘導時間。然而，目前技術難以通過體外誘導分化得到足夠數量的單一且成熟的多巴胺能神經元，而且移植后的細胞存活數量有限、移植細胞不易與原有神經網絡融合都在一定程度上限制了其臨床應用。因此，在細胞替代治療帕金森病，提高骨髓間充質干細胞定向誘導分化為多巴胺能神經元的分化效率是解決這些問題的關鍵。

發明內容