[發明專利]一種原代間充質干細胞的提取、培養和傳代培養方法在審
| 申請號： | 201811048280.8 | 申請日： | 2018-09-07 |
| 公開（公告）號： | CN109593709A | 公開（公告）日： | 2019-04-09 |
| 發明（設計）人： | 劉世明;劉寧寧;徐如芹;劉彬;張方程 | 申請（專利權）人： | 廣州醫科大學附屬第二醫院 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 廣州三環專利商標代理有限公司 44202 | 代理人： | 劉孟斌 |
| 地址： | 510260 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 間充質干細胞 傳代培養 換液 傳代 胰酶消化液 分離培養 胰酶消化 原代培養 原代細胞 大鼠骨髓間充質干細胞 細胞生長活力 最大程度地 集落細胞 集落形成 細胞融合 營養支持 保證 保留 | ||
1.一種原代間充質干細胞的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)取SPF級3～4周齡的雄性SD大鼠拉頸處死后，用75％乙醇浸泡5min；
(2)快速分離乙醇浸泡后大鼠的雙側股骨及脛骨，在含有預冷的PBS緩沖液的培養皿中去除股骨和脛骨周圍的肌肉組織和結締組織，剪去包括骺板在內的兩側骺端和軟骨組織，并用預冷的PBS緩沖液反復沖洗分離下來的股骨和脛骨；
(3)用注射器抽取15ml預冷的含10％FBS和1％雙抗的DMEM/F12完全培養基沖洗步驟(2)所得大鼠的骨髓腔，反復沖洗3～4遍直至骨髓腔發白；
(4)用1ml槍頭反復吹打步驟(3)獲得的骨髓沖洗液，制成單細胞懸液，室溫靜置至大塊組織和骨骼碎片沉降到離心管底部后，輕輕吸取全骨髓細胞懸液接種于培養瓶中，放到37℃濃度為5％CO2細胞培養箱中靜置培養，至少72h后首次完全換液，去除未貼壁細胞，得到的貼壁細胞中含有所述原代間充質干細胞。
2.一種原代間充質干細胞的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)取權利要求1制得的貼壁細胞，每2～3天完全換液；
(2)培養至第7～10天，顯微鏡下觀察到大量細胞集落形成，即得原代間充質干細胞，可用于后續的傳代培養。
3.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，所述步驟(2)中，培養至第7天所得原代間充質干細胞，即用于傳代培養。
4.一種原代間充質干細胞的傳代培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)取權利要求2或3培養所得原代間充質干細胞，加入預處理的質量濃度為0.125％胰酶，使胰酶均勻覆蓋全部的原代間充質干細胞，室溫下控制胰酶消化時間為1～2min；
(2)通過鏡下觀察，當細胞開始變圓時，輕拍培養瓶底部，使細胞脫落下來，立即加入完全培養基終止胰酶消化；
(3)輕輕吹打細胞培養瓶底部后收集細胞懸液，棄上清后，用完全培養基重懸，吹打至單細胞懸液，然后按照比例稀釋、傳代培養。
5.根據權利要求4所述的傳代培養方法，其特征在于，所述步驟(1)中胰酶的預處理的具體步驟為:用37℃預熱的PBS緩沖液洗滌2～3次。
6.根據權利要求4所述的傳代培養方法，其特征在于，所述完全培養基為DMEM/F12。
7.根據權利要求4或6所述的傳代培養方法，其特征在于，所述完全培養基與胰酶的體積比為4：1。
8.根據權利要求4所述的傳代培養方法，其特征在于，所述步驟(3)中細胞懸液離心的具體步驟為：800rpm離心3分鐘。
9.根據權利要求4所述的傳代培養方法，其特征在于，所述步驟(3)中根據單細胞懸液的細胞密度，按照1：3或者1：2稀釋進行傳代培養。
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