[發明專利]微莖尖培養結合熱處理獲得增城蜜菊脫毒苗的培育方法

有效

• 申請號: 201811046291.2
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109258460B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 巫宗華;張華通;羅晶晶;張宏金
• 申請（專利權）人: 廣州田園牧歌農林有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐晶

1.一種微莖尖培養結合熱處理獲得增城蜜菊脫毒苗的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)優良株系選育

種植增城蜜菊原種，經觀察，篩選出9株性狀優良的單株，組織培養后獲得幼苗，用獲得的幼苗進行栽培種植試驗，再從中篩選出6株性狀優良的單株，同樣經組織培養后進行栽培種植試驗，最終篩選出3株性狀優良的單株；

(2)組織培養無菌組培瓶苗建立

取步驟(1)獲得的3株性狀優良的單株中的嫩枝作為外植體，并進行消毒處理，然后將外植體接種到培養基JHr進行不定芽誘導培養20-25天；切取經不定芽誘導培養的芽作材料進行增殖繼代培養，接種到培養基JH4中，每瓶培養基接種8節；切取經繼代增殖培養的不定芽作材料進行生根誘導，接種后，用保鮮膜封好瓶口，放到塑料大棚進行生根煉苗，20～25天即得無菌組培瓶苗；

(3)熱處理培養預脫毒

將步驟(2)所得的無菌組培瓶苗放入光照培養箱進行熱處理培養，在溫度為40℃、光照強度為2000Lux的光照培養箱中每天光照10h，連續培養72h，得預脫毒的培育苗；

(4)微莖尖培養脫毒

在無菌條件下于超凈工作臺解剖鏡下切取步驟(3)所得預脫毒的培育苗的莖尖1.9～2.1cm，接種到脫毒莖尖不定芽誘導培養基JH7，在光照強度為2500～3500Lux、光照時間為7.0～8.0h、溫度為23～27℃的條件下，培養25～30天，得脫毒不定芽；

(5)脫毒莖尖組織培養無菌繁殖體系建立

將步驟(4)所得的脫毒不定芽進行增殖繼代培養，接種到不定芽初代培養基JH4中，在光照強度為2500～3500Lux，光照時間為7.0～8.0h，培養溫度為23～27℃的條件下，培養20～25天，得脫毒莖尖組織培養苗；

(6)脫毒莖尖組織培養苗病毒檢測

將步驟(5)所得脫毒莖尖組織培養苗用分子生物學鑒定法進行RNA病毒檢測，篩選出不帶病毒的脫毒莖尖組織培養苗；

(7)脫毒苗組培工廠化育苗

將步驟(6)中篩選出的不帶病毒的脫毒莖尖組織培養苗接種到培養基JHr中誘導生根，培養20-25天后，得組培瓶脫毒苗；將所得組培瓶脫毒苗轉移到塑料大棚進行生根煉苗，培養20-25天，得增城蜜菊脫毒苗；

所述步驟(4)中脫毒莖尖不定芽誘導培養基JH7，包括：ZL培養基+0.2mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鮮椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％復合卡拉膠，pH5.8；所述復合卡拉膠由以下組分及重量百分數組成：10％海藻酸鈣，50％I-型卡拉膠和40％去離子水；

所述步驟(2)和步驟(7)中的培養基JHr包括：ZL培養基+0.2mg/Lα-萘乙酸+1.5％蔗糖+0.55％復合卡拉膠，pH5.8；所述復合卡拉膠由以下組分及重量百分數組成：10％海藻酸鈣，50％I-型卡拉膠和40％去離子水；

所述步驟(2)和步驟(5)中的不定芽初代培養基JH4包括：ZL培養基+1.5mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+3.0％蔗糖+0.55％復合卡拉膠，pH5.8；所述復合卡拉膠由以下組分及重量百分數組成：10％海藻酸鈣，50％I-型卡拉膠和40％去離子水；

所述ZL培養基由以下組分組成：

2.如權利要求1所述微莖尖培養結合熱處理獲得增城蜜菊脫毒苗的培育方法，其特征在于，所述復合卡拉膠的制備方法為：將I-型卡拉膠加入到去離子水中，升溫至60-80℃至完全溶解后，加入海藻酸鈣攪拌均勻，冷卻至室溫，即得。

3.一種用于增城蜜菊脫毒苗培育的脫毒莖尖不定芽誘導培養基JH7，其特征在于，由以下組分組成：ZL培養基+0.2mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鮮椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％復合卡拉膠，所述培養基的pH為5.8；所述的復合卡拉膠由以下組分及重量百分數組成：10％海藻酸鈣，50％I-型卡拉膠和40％去離子水；所述ZL培養基由以下組分組成：

4.如權利要求3所述的用于增城蜜菊脫毒苗培育的脫毒莖尖不定芽誘導培養基JH7，其特征在于，所述復合卡拉膠的制備方法為：將I-型卡拉膠加入到去離子水中，升溫至60-80℃至完全溶解后，加入海藻酸鈣攪拌均勻，冷卻至室溫，即得。