[發(fā)明專利]一種海洋低溫蘋果酸脫氫酶基因及其重組表達(dá)載體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811043135.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN109161555A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張慶芳;肖景惠;王夢(mèng)雨;遲乃玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 大連八方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21226
• 代理人: 朱秀芬

1.一種海洋低溫蘋果酸脫氫酶基因，其特征在于，所述基因具有序列表中的SEQ IDNO：1所示的堿基序列。

2.如權(quán)利要求1所述的一種海洋低溫蘋果酸脫氫酶基因，其特征在于，所述基因具有序列表中的SEQ ID NO：2所示的堿基序列編碼的蛋白序列。

3.一種包含權(quán)利要求1所述基因的堿基序列的表達(dá)載體。

4.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，所述方法為：

(1)以太平洋海洋桿菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)基因組DNA為模板，在距離海洋低溫蘋果酸脫氫酶基因(MDH)兩端一定長度處設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCP擴(kuò)增，得到的基因命名為EMDH，該基因片段中包含了MDH基因的全序列；

(2)海洋低溫MDH基因序列擴(kuò)增

得到海洋低溫EMDH片段后，再設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物需與海洋低溫MDH基因片段具有約20bps同源序列，與pET-28a(+)載體具有約30bps同源序列，以海洋低溫EMDH基因?yàn)槟０澹瑪U(kuò)增出海洋低溫MDH基因；

(3)將擴(kuò)增后海洋低溫MDH基因片段作為大引物，載體pET-28a(+)為模板進(jìn)行PCR，得到具有海洋低溫MDH基因的載體質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)目的基因插入到載體中；

(4)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取9μl樣品，加入1μl DpnI進(jìn)行消化(37℃，12h)，消化掉甲基化的母系目標(biāo)載體；隨后電轉(zhuǎn)到DH5α菌株細(xì)胞中；挑取陽性單菌落，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并DNA測(cè)序驗(yàn)證。

5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有如權(quán)利要求1所述基因或包含權(quán)利要求3所述表達(dá)載體。