[發明專利]一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法

在審

• 申請號: 201811040997.8
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN110885779A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 秦建華;王亞清;王慧
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：該模型的構建方法的主要步驟為：

(1)器官芯片的制備與修飾；

(2)擬胚體EBs的形成；

(3)類肝在器官芯片中的分化和成熟。

2.按照權利要求1所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：所述的器官芯片主要由培養液入口(1)、灌流通道(2)、柱形陣列(3)、培養液出口(4)組成，液體由培養液入口(1)進入后通過含有柱形陣列(3)的灌流通道(2)，再由出口(4)流出。

3.按照權利要求2所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：所述器官芯片灌流通道寬度范圍為5mm-10mm，灌流通道高度范圍為1-1.3mm，柱形陣列結構中小柱直徑范圍為500μm-1mm，小柱高度范圍為500-800μm，小柱間間距范圍為50-100μm。

4.按照權利要求2所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：所述器官芯片由上下兩層不可逆封接而成，上下層材料均為透明透氣的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。

5.按照權利要求1所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：步驟(1)器官芯片的制備與修飾，具體步驟為：器官芯片的制備采用傳統的光刻技術，將形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修飾，95℃烘5min，以便SU8模板疏水盡量不粘附PDMS；之后用PDMS聚合物反模即形成上、下層PDMS芯片；所述器官芯片層的上下兩層分別經過氧氣等離子體處理20-90s進行不可逆封接；封接之后，經過高溫高壓滅菌處理；

封接好的芯片用一定濃度的PF127修飾數小時，用培養基清洗數次浸泡過夜備用。

6.按照權利要求5所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：PF127修飾芯片的濃度范圍為0.1％-2％，修飾時間為4-24h。

7.按照權利要求1所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：步驟(2)擬胚體EBs的形成，具體步驟為：采用步驟(1)制備的器官芯片，將人多能干細胞用消化液消化成單細胞，離心500-800rpm，3-5min，用商業化的mTESR1培養基重懸細胞至合適的細胞密度，并接種至已制備好的器官芯片中，細胞懸液從器官芯片培養液入口處進入，其中培養基中加入一定濃度的Y27632因子，靜置培養1天。

8.按照權利要求7所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于所述人多能干細胞為人iPSCs細胞，細胞接種密度范圍為2×10³～6×10⁶cells/ml，Y27632濃度范圍為5-10μM。

9.按照權利要求1所述的一種基于器官芯片的三維類肝組織模型構建方法，其特征在于：步驟(3)類肝在器官芯片中的分化和成熟，具體步驟為：

(1)形成EBs一天后開始向內胚層誘導分化：將mTESR1培養基替換為1640+B27培養基,并連續灌流5天；

所述1640+B27培養基的基礎成分為商業化的RPMI-1640培養基，需添加占總體積1％的B27；另外需添加的誘導因子為高濃度的activin-A，

(2)誘導肝前體細胞分化和增殖：在1640+B27培養基添加HGF和bFGF因子并連續灌流5天；

(3)促進肝細胞進一步成熟：1640+B27培養基更換為商業化的肝細胞培養基HCM，另外需添加OSM因子和地塞米松Dex，并連續灌流5天；

(4)類肝的長期培養：培養第15天以后，培養基去掉OSM因子，更換為只含Dex的HCM培養基，連續灌流，后續可進行長期的培養，可培養至30天并進行功能鑒定，經鑒定此方法可模擬肝的發育和形成過程。