[發明專利]一種豬凝血酶的制備方法

在審

• 申請號: 201811040796.8
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109182315A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 劉騫
• 申請（專利權）人: 無錫凱夫制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74
• 代理公司: 連云港聯創專利代理事務所(特殊普通合伙) 32330
• 代理人: 劉剛

1.一種豬凝血酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)血漿的制備

向收集的新鮮豬血中加入檸檬酸鈉溶液，15℃以下，離心分離血紅細胞和血漿，所得血漿置于-20℃凍存；

2)S/D法病毒滅活

將經過室溫解凍的血漿用定性濾紙過濾，所得濾液加入曲拉通X-100和磷酸三丁酯，攪拌3～6小時；

3)凝血酶原粗品制備

將經過S/D滅活處理的血漿用定性濾紙過濾，所得濾液中加入DEAE Sephadex A-50凝膠，攪拌；過濾，棄去濾液；配置0.01～0.1moL/L的檸檬酸鈉、0.05～0.8moL/L氯化鈉溶液的高鹽洗滌液，先用高鹽溶液淋洗凝膠除去雜蛋白；再用高鹽溶液洗脫液浸泡凝膠10～20分鐘，過濾，重復三次或三次以上，收集濾液；

4)凝血酶激活液制備

向上述濾液中加入氯化鈣溶液，調整濾液中Ca⁺的濃度最終調節為0.02～0.15moL/L，25℃～32℃攪拌激活0.5小時；

5)凝血酶純化

以Sp-Sepharose FF填充的柱子，將上述凝血酶激活液按1:3～6的比例用檸檬酸鈉溶液稀釋，上樣；上樣完畢后用高鹽洗滌液淋洗≥3個柱體積，洗滌雜蛋白；再用高鹽洗滌液洗脫2個柱體積，收集凝血酶純品；

6)超濾脫鹽

將上述收集液進行超濾脫鹽；

7)納米膜除病毒

將DV20NI0552納濾膜正確安裝后，給儲液罐中的超濾濃縮液加壓，維持濾膜前后的壓差在2～5bar，過濾超濾濃縮液，得到凝血酶溶液。

2.如權利要求1所述的豬凝血酶的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中曲拉通X-100和磷酸三丁酯的添加量為0.3％-2％。

3.如權利要求1所述的豬凝血酶的制備方法，其特征在于，所述高鹽洗滌液的pH為6～9。

4.如權利要求1所述的豬凝血酶的制備方法，其特征在于，將所述步驟5)中高鹽洗滌液中的檸檬酸鈉替換為檸檬酸三鈉或三(羥甲基)氨基甲烷。