[發明專利]一種血脊髓屏障OGD/R損傷模型及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201811038022.1
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109234233A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 李在望;蔡小軍
• 申請（專利權）人: 無錫市人民醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

1.一種血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）脊髓來源的混合膠質細胞原代培養；

2）脊髓來源的微血管內皮細胞的原代培養；

3）利用transwell共培養體系建立體外BSCB模型：將融合后的脊髓來源的混合膠質細胞用胰酶消化，脊髓來源的微血管內皮細胞用ACCUTASE消化，離心后，將重懸的微血管內皮細胞接種于transwell上室內，混合膠質細胞接種于transwell底室，待細胞貼壁后，予換液；

4）血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建：待細胞90%以上融合后，將所有培養基棄去，更換成無糖無血清的培養基，transwell置于缺氧培養箱中，培養3h后取出，重新更換為原培養基，在普通細胞培養箱中進行復氧即得脊髓屏障OGD/R損傷模型。

2.根據權利要求1所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建方法，其特征在于，所述步驟1）的混合膠質細胞包括星形膠質細胞和小膠質細胞。

3.根據權利要求1所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建方法，其特征在于，所述步驟2）脊髓來源的微血管內皮細胞的原代培養步驟如下：

a）將脊髓組織機械消化離心收集沉淀，離心后的沉淀在預熱的ACCUTASE中消化，37℃水浴中震蕩30min；

b）消化后的組織離心，沉淀重懸于BSA終止消化；

c）離心后，將上層吸除，沉淀物包含血管段，用HBSS清洗多遍；

d）離心后沉淀即為獲得的脊髓微血管內皮細胞，用ACCUTASE消化，37℃，30min；

e）加入含血清培養基終止消化，離心；

f）步驟e）離心后的沉淀物沖洗，重懸于含血清培養基，接種于細胞培養瓶中，細胞融合90%后予傳代。

4.根據權利要求3所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建方法，其特征在于，所述步驟e）和步驟f）中的含血清培養基為：DMEM/F12，10~20%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素混合液，ECGF 30ng/ml。

5.根據權利要求1所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建方法，其特征在于，所述步驟3）中的缺氧培養箱中的培養條件是37℃、5%CO₂、95%N₂。

6.根據權利要求1所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型的構建方法，其特征在于，所述步驟3）中的復氧時間為3~48h。

7.權利要求1~6所述的構建方法獲得的血脊髓屏障OGD/R損傷模型。

8.權利要求7所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型在篩選保護或治療血脊髓屏障損傷藥物中的應用。

9.權利要求7所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型在制備診斷血脊髓屏障損傷的試劑中的應用。

10.權利要求7所述的血脊髓屏障OGD/R損傷模型在制備保護或治療血脊髓屏障損傷的藥物中的應用。