[發明專利]引物去磷酸化引發的循環指數擴增檢測堿性磷酸酶的方法

在審

• 申請號: 201811037977.5
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109161583A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 張春陽;王黎娟;王子月
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/42
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王磊

本發明公開了引物去磷酸化引發的循環指數擴增檢測堿性磷酸酶的方法，采用傳感器由DNA引物、發夾探針1和發夾探針2組成，發夾探針1和發夾探針2的5'端堿基均修飾熒光基團，與發夾探針1的5'端堿基互補的堿基修飾淬滅基團；與發夾探針2中的5'端堿基互補的堿基修飾淬滅基團，發夾探針1中的淬滅基團和3'端之間的堿基序列與DNA引物的堿基序列互補，發夾探針1的5'端和發夾探針1酶切識別序列之間堿基序列與發夾探針2中的淬滅基團與3'端之間的堿基序列互補，發夾探針2的5'端和發夾探針2酶切識別序列之間堿基序列與DNA引物的堿基序列互補。本發明的方法能夠快速、超靈敏的檢測堿性磷酸酶的活性。

技術領域

本發明屬于生物分析技術，涉及引物去磷酸化引發的循環指數擴增檢測堿性磷酸酶的方法。

背景技術

堿性磷酸酶(ALP)是一種廣泛分布的水解酶，其催化各種磷酸化底物(例如蛋白質，碳水化合物和核酸)的去磷酸化，其在調控細胞周期，生長，凋亡、信號轉導途徑等多個細胞內過程中起著重要的作用。ALP的異常水平與骨疾病(例如佩吉特氏病，骨軟化癥和成骨細胞性骨癌)、肝臟疾病(例如梗阻性黃疸、肝炎和肝癌)、糖尿病、乳腺癌和前列腺癌等各種人類疾病密切相關。此外，由于其高催化活性，良好的穩定性和廣泛的底物特異性，ALP是酶免疫測定、基因表達分析、組織化學染色和生物分子監測中使用最廣泛的標記示蹤劑之一。因此，開發一種有效可靠的ALP活性檢測方法對于臨床診斷和藥物研發具有十分重要的意義。

目前為止，已經開發了多種方法來測量ALP的活性/水平，包括基于放射性標記的電泳法、色譜法、表面增強拉曼散射法、比色法、化學發光法和電化學測定法。盡管這些方法都具有各自的特色，但是它們會受到諸如有害輻射、靈敏度差、操作復雜、程序耗時、樣品處理復雜、儀器昂貴以及需要蛋白質抗體固定在固體支持物上的限制。熒光方法具有快速分析、高靈敏、高通量、儀器簡單、分析性能優等顯著優點，所以將熒光方法與貴金屬納米團簇(如銅納米粒子和銀納米團簇)、無機半導體(如碳量子點、硫化銅銦量子點、碳點和石墨量子點)、熒光聚合物(如聚乙烯亞胺聚合物，聚對苯二甲酸乙二醇酯纖維和雙氰胺化合物)和熒光劑(如Fmoc-K FITC FFYP)相結合，可用于ALP活性的測定。如利用銅離子(Cu²⁺)和焦磷酸(PPi)之間的強烈相互作用，PPi可以抑制雙鏈DNA(dsDNA)為模板的銅納米顆粒(CuNPs)熒光而實現對ALP的信號關閉熒光檢測。而利用Cu²⁺介導的單鏈DNA(ssDNA)為模板的銀納米團簇的淬滅，也可實現對ALP的信號關閉熒光檢測?；赑Pi去磷酸化介導的PPi-Cu²⁺-PPi復合物拆分，實現對ALP的信號關閉熒光檢測。利用PPi可以將硝基苯酯(PNPP)轉化為PNP，從而來誘導碳點(CD)的淬滅，實現ALP的信號關閉熒光檢測。而通過ALP誘導的含有一個磷酸基團的芘衍生物(Py-P，脂肪族磷酸酯)的熒光強度比(F378/F488)的增加，發展出用于ALP測定的熒光比率法。但是，以上所述熒光方法均涉及到熒光納米材料的復雜合成和費時費力的實驗操作，且由于信號關閉(signal-off)測定導致準確性差，由于缺乏信號放大導致靈敏度差。同時，在臨床診斷中，由于成人體內ALP為40～190單位每升，含量較低，因而現有技術無法對低濃度ALP的活性進行高敏感檢測。

發明內容

為了解決現有技術的不足，本發明的目的之一是提供一種循環指數擴增檢測堿性磷酸酶的傳感器，采用該傳感器能夠快速、超靈敏的檢測堿性磷酸酶的活性。

為了實現上述目的，本發明的技術方案為：

一種循環指數擴增檢測堿性磷酸酶的傳感器，由DNA引物、發夾探針1(HP1)和發夾探針2(HP2)組成；

DNA引物為單鏈DNA序列，DNA引物的3'端為磷酸化末端，發夾探針1和發夾探針2的均具有突出的3'端，發夾探針1和發夾探針2的5'端堿基均修飾熒光基團，與發夾探針1的5'端堿基互補的堿基修飾淬滅基團；