[發明專利]一種基于微量法的輔酶A含量測定試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201811037069.6
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109211817A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 姚金美;趙林川
• 申請（專利權）人: 蘇州科銘生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N21/3577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種基于微量法的輔酶A含量測定試劑盒及其方法，該試劑盒的組分包括由Tris?HCl、巰基乙醇、PMSF和甘油組成的試劑一，由Tris?HCl和水組成的試劑二，由MgCl₂、酮戊二酸、魚藤酮和TPP組成的試劑三，由NAD組成的試劑四，由α?酮戊二酸脫氫酶組成的試劑五。該方法的原理為α?酮戊二酸脫氫酶可催化輔酶A、α?酮戊二酸和NAD⁺生成琥珀酰輔酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，在反應體系中加入α?KGDH、α?酮戊二酸和NAD⁺，輔酶A含量和NADH的生成速率成正比。本發明具有適用范圍廣泛，檢測靈敏度高，檢測時間短，試劑用量少，成本極低的優點。

技術領域

本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種基于微量法的輔酶A含量測定試劑盒及其方法。

背景技術

輔酶A是生物體內轉酰酶和α-酮戊二酸脫氫酶的輔酶，對糖的分解、脂肪酸的合成和分解、氨基酸的代謝等多種生化反應起重要作用。輔酶A在臨床上主要用于脂類代謝異常引起的疾病和其他疾病的輔助治療。

目前市面上已有的輔酶A含量測定方法為高效液相色譜法，該方法的缺點在于：1、對儀器設備的要求較高，2、所用流動相較高濃度的磷酸鹽對色譜柱的損耗較高，3、不能適用于動物、植物和微生物等多種樣本的輔酶A的檢測，4、單個樣本檢測時間太長，5、最低檢測限不夠低。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明旨在提供一種基于微量法的輔酶A含量測定試劑盒及其方法，具有適用性廣泛，靈敏度高，檢測時間短，藥劑用量小等特點。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

一種基于微量法的輔酶A含量測定試劑盒，包括以下試劑：

試劑一，液體100mL×1瓶，由Tris-HCl緩沖溶液、巰基乙醇、PMSF和甘油組成，置于100mL容量瓶中， 4℃保存；

試劑二，液體20mL×1瓶，由Tris-HCl緩沖溶液和水組成，置于20mL容量瓶中，4℃保存；

試劑三，粉劑×1瓶，由MgCl₂、α-酮戊二酸、魚藤酮和TPP組成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；

試劑四，粉劑×1支，由NAD組成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；

試劑五，粉劑×1支，由α-酮戊二酸脫氫酶組成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存。

進一步的，所述試劑一中含有的Tris-HCl緩沖溶液的物質的量濃度為50mM，pH為7.5，體積為100mL，巰基乙醇的體積為74uL，PMSF的物質的量濃度為100mM，體積為1mL，甘油的體積為 5mL。

進一步的，所述試劑二中含有的Tris-HCl緩沖溶液的物質的量濃度為50mM ，體積為16.2mL， pH為7.4，水的體積為3.8mL。

進一步的，所述試劑三中含有的MgCl₂的質量為4.2mg，α-酮戊二酸的質量為3mg，魚藤酮的質量為4mg，TPP的質量為2mg。

進一步的，所述試劑四中含有的NAD的質量為23mg。

進一步的，所述試劑五中含有的α-酮戊二酸脫氫酶的酶活力為2500U/mg，質量為0.4mg。

一種利用上述試劑盒的基于微量法的輔酶A含量測定方法，具體步驟如下：

步驟1 儀器和用品的準備；

準備紫外分光光度計或酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研缽、冰和蒸餾水；