[發明專利]一種測定殼寡糖含量的方法

有效

• 申請號: 201811036765.5
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109030445B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 蘇政權;曹華
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐晶

本發明涉及一種測定殼寡糖含量的方法，屬于大分子檢測技術領域。本發明采用苯酚?熒光分光光度法，利用殼寡糖與苯酚溶液混合后，殼寡糖的氨基和苯酚的羥基結合，使混合水溶液的pH值改變，苯酚發生熒光淬滅，導致熒光強度呈指數下降，使殼寡糖的濃度與熒光對數值在一定范圍內呈線性關系，用于殼寡糖的含量測定。此方法費用低，靈敏度高，穩定性強，重現性好，檢測濃度范圍為0～2.4mg/ml，使用廣泛，可用于不同劑型殼寡糖的含量測定，解決了現有技術中操作繁瑣、成本高、準確性低、測定范圍窄的問題。

技術領域

本發明屬于大分子檢測領域，涉及一種測定殼寡糖含量的方法。

背景技術

殼寡糖(又稱寡聚氨基葡糖、甲殼低聚糖、Chitosan Oligosaccharide，Chito-oligosaccharide，Oligochitosan)由甲殼質(幾丁質)脫乙酰化的產物殼聚糖降解獲得，是由2-10個氨基葡糖通過β－1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，也是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖，水溶性好，易被動物體吸收。殼寡糖原材料來源廣泛，安全無毒，其具有的抗炎、增強免疫力、抗腫瘤、抑菌、清除自由基、抗氧化等生理活性已引起國內外醫藥研究者的廣泛關注。在作物栽培領域，殼寡糖具有調控植物生長和防治植物病害等生物活性，被作為抗病毒制劑，廣泛用于黃瓜、番茄等多種蔬菜生產中。在醫藥領域，殼寡糖具有調節免疫力、抗氧化、抑制腫瘤生長及抗炎反應、增強骨強度、抗菌、抗瘧疾等作用。因此在農業、食品、醫藥等領域具有廣闊的應用前景。但是在殼寡糖產品的質量控制中，除了要測定殼寡糖的脫乙酰度、聚合度和相對分子量，還需要確定產品中殼寡糖的實際含量，現有方法對產品中殼寡糖的含量測定準確性低，致使產品中殼寡糖含量的測定方法的不成熟和饋乏。

當前，殼寡糖的含量分析方法主要有三大類：高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TLC)和分光光度法。HPLC法采用示差檢測器檢測或紫外檢測器檢測，該方法靈敏度高、準確可靠，但操作過程繁瑣，樣品處理和分析時間長。TLC法穩定性差，測定誤差大，準確性低，無法保證測得產品質量優劣。分光光度法是較為傳統的殼寡糖檢測的方法，得到多次改進，但依然存在水解不徹底、含量測定范圍低窄問題，增加測定結果的誤差。另外，如中國專利申請號201711493051.2公開了一種以水溶性苯胺藍為探針的紫外可見分光光度法測定殼寡糖，水解殼寡糖也可利用紫外分光光度法精確測得殼寡糖含量，但是該方法中苯胺藍-殼寡糖體系受溫度、pH值影響，操作步驟多，穩定性差。綜上，殼寡糖含量的測定方法依然需要不斷的改進和更新。因此，建立一種簡單易行而又準確的測定產品中殼寡糖含量的方法極為迫切。

發明內容

為改進現有技術中對殼寡糖的含量測定方法誤差大、穩定性低，耗時費力，尤其是不能廣泛應用于殼寡糖不同制劑含量測定等缺點，本發明旨在提供一種測定不同劑型殼寡糖含量的方法。本發明采用苯酚-熒光分光光度法，利用殼寡糖與苯酚溶液混合后，殼寡糖的氨基和苯酚的羥基結合，使混合水溶液的pH值改變，苯酚發生熒光淬滅，導致熒光強度呈指數下降，使殼寡糖的濃度與熒光對數值在一定范圍內呈線性關系，可用于殼寡糖的含量測定。此方法費用低，靈敏度高，穩定性強，重復性好，檢測濃度范圍為0～2.4mg/ml，使用廣泛，可用于殼寡糖片劑、顆粒劑和滴丸等不同制劑中殼寡糖的含量測定。

一種測定殼寡糖含量的方法，包括如下步驟：

1)繪制殼寡糖的標準曲線：向比色管中分別加入0、0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml充分溶解于蒸餾水的4.00mg/ml的殼寡糖標準品儲備液，后加入100μl苯酚水溶液，蒸餾水定容，搖勻，制備得到濃度梯度為0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的殼寡糖標準溶液，于熒光分光光度儀上測定熒光強度值F，建立lnF與殼寡糖濃度X之間的線性關系；

2)樣品工作液的配備：取殼寡糖待測樣品，加入蒸餾水，混合均勻，配制成濃度為3～5mg/ml的殼寡糖溶液；