[發明專利]一種通過外膜缺陷制備革蘭氏陰性細菌感受態細胞的方法

有效

• 申請號: 201811036515.1
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN110878276B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 陳國強;王子瑜;秦琴
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/87;C12R1/01;C12R1/19;C12R1/38
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種制備革蘭氏陰性細菌感受態細胞的方法，包括對革蘭氏陰性細菌制造外膜缺陷的步驟；

所述方法包括如下步驟：

(1)敲除和/或抑制革蘭氏陰性細菌的基因組中與外膜脂多糖相關的基因，獲得外膜缺陷型菌株；

(2)利用所述外膜缺陷型菌株制備感受態細胞；

步驟(1)中，所述與外膜脂多糖相關的基因為如下中至少一種：

(a1)外膜脂質A合成和修飾相關基因；

(a2)外膜脂多糖合成和修飾相關基因；

(a3)外膜脂多糖轉運相關基因；

所述外膜脂質A合成和修飾相關基因為如下基因中至少一種：LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、kdtA基因、LpxL基因和LpxM基因；

所述外膜脂多糖合成和修飾相關基因為如下基因中至少一種：MsbA基因、WzX基因、WzY基因、WaaL基因、WaaF基因和WaaC基因；

所述外膜脂多糖轉運相關基因為如下基因中至少一種：LptA基因、LptB基因、LptC基因、LptD基因、LptE基因、LptF基因和LptG基因。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，利用所述外膜缺陷型菌株制備所述感受態細胞是在室溫或低溫下進行的。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，利用所述外膜缺陷型菌株制備所述感受態細胞是按照包括如下步驟的方法進行的：將所述外膜缺陷型菌株用緩沖溶液處理后獲得所述感受態細胞；

所述緩沖溶液的溶劑為水，溶質為如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)蔗糖和甘油；

(b2)甘油；

(b3)蔗糖。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：在(b1)所示的所述緩沖溶液中，所述蔗糖的含量為200-600mM；所述甘油的體積百分含量為5-20％；

在(b2)所示的所述緩沖溶液中，所述甘油的體積百分含量為5％-20％；

在(b3)所示的所述緩沖溶液中，所述蔗糖的含量為200-600mM。

5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述革蘭氏陰性細菌為嗜鹽菌、假單胞菌或大腸桿菌。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述革蘭氏陰性細菌為嗜鹽單胞菌或嗜蟲假單胞菌。

7.利用權利要求1-4中任一所述的方法制備得到的革蘭氏陰性細菌的感受態細胞。

8.根據權利要求7所述的感受態細胞，其特征在于：所述革蘭氏陰性細菌為嗜鹽菌、假單胞菌或大腸桿菌。

9.根據權利要求8所述的感受態細胞，其特征在于：所述革蘭氏陰性細菌為嗜鹽單胞菌或嗜蟲假單胞菌。

10.權利要求9所述的感受態細胞在以電轉或化學轉化方式被導入DNA分子中的應用。

11.利用權利要求1-4任一中的步驟(1)制備得到的所述的外膜缺陷型菌株在制備革蘭氏陰性細菌的感受態細胞中的應用。

12.根據權利要求10或11所述的應用，其特征在于：所述革蘭氏陰性細菌為嗜鹽菌、假單胞菌或大腸桿菌。

13.根據權利要求12所述的應用，其特征在于：所述革蘭氏陰性細菌為嗜鹽單胞菌或嗜蟲假單胞菌。