[發(fā)明專利]一種利用苧麻BnXTH1基因提高植物耐鎘能力的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811035540.8
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN108998472B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 揭雨成;馬玉申;邢虎成
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/20;C12N15/54
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種利用苧麻BnXTH1基因提高植物耐鎘能力的方法，其特征在于，所述方法具體為將BnXTH1基因在擬南芥中進行過表達；所述BnXTH1基因的完整的開放閱讀框如SEQ ID NO:1所示，編碼氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用苧麻BnXTH1基因提高植物耐鎘能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

S1、BnXTH1基因過表達載體的構(gòu)建；

1.1)提取苧麻整株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

1.2)以步驟1.1)得到的cDNA為模板，采用引物BnXTH1-F和BnXTH1-R進行PCR擴增，得到帶酶切位點的BnXTH1的開放閱讀框；

BnXTH1-F:CCCCCGGGGACATAATGTGGTCGGAAGAT；

BnXTH1-R:CGAGCTCTCAATCCCAAGGGCTCAATG；

1.3)將表達載體pBI 121和BnXTH1片段進行酶切，酶切體系如下：

25℃反應10h后，65℃20min滅活內(nèi)切酶，然后加入：

BamHI/SacI 1μL

10×NEB Buffer 1μL

ddH2O 8μL

37℃反應過夜，凝膠電泳膠回收目的PCR片段；

1.4)采用T4連接酶將步驟1.3)中得到的PCR片段與載體片段連接，具體體系如下：

25℃反應3h，進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化；

1.5)質(zhì)粒提?。?/p>

將步驟1.4)中成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌采用質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取；

1.6)轉(zhuǎn)化EHA105：

利用步驟1.5)提取得到的質(zhì)粒進行農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化；

S2、對擬南芥進行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化：

2.1)接種農(nóng)桿菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，搖菌至OD＝1.2；

2.2)4℃離心收集菌體，加入含0.03％Silweet-77的1/2MS液體培養(yǎng)基重懸，使其OD＝0.8，得到農(nóng)桿菌重懸液；

2.3)對擬南芥轉(zhuǎn)化前，去掉角果與盛開的花；

2.4)將擬南芥的花序完全浸入步驟2.2)得到的農(nóng)桿菌重懸液中50s，套上白色薄膜，外加黑色薄膜，斜置24h，1d后去薄膜，正常培養(yǎng)；7天后重復浸染一次，一月后收獲種子低溫烘干，放4℃條件下保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1.6)的具體流程包括：

1.6.1)將2μL步驟1.5)提取得到的質(zhì)粒加入到100μL EHA105感受態(tài)細胞中，輕彈混勻；

1.6.2)冰浴30min后，液氮速凍3min，再37℃水浴5min；

1.6.3)加入800μL無抗生素的LB培養(yǎng)基，200rpm、28℃震蕩培養(yǎng)3h；

1.6.4)5000rpm離心5min，留100μL上清懸浮菌液，涂板到含利福平和卡那霉素的固體YEP培養(yǎng)基上，倒置28℃培養(yǎng)48h；

1.6.5)陽性克隆檢測：挑取單菌落與10μL ddH₂O，混勻后，取2μL與25μL PCR體系，用目標基因R引物與pBI121 35S-F鑒定，剩下的混合液加入1mL含利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，PCR鑒定正確的菌株甘油保存；

所述pBI121 35S-F為：

pBI 121 35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC；

所述目標基因R引物為：

BnXTH1-test-R：ATGGCTGTCCACTCCTATTCC。