[發明專利]一種快速檢測SNP位點的熒光定量試劑盒

在審

• 申請號: 201811034661.0
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109913538A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 蔣健暉;王海波;唐麗娟;鐘志堅;李武
• 申請（專利權）人: 湖南融健基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 陳松

本發明提供了一種快速檢測SNP位點的熒光定量試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括SNP位點識別的第一類引物、協助第一類引物進行SNP特征序列恒溫擴增的第二類引物和第三類引物、核苷酸單體混合物、核糖核酸內切酶、核酸聚合酶和核酸雙鏈熒光染料的反應混合液，以及使用說明書，反應體系采用引物激活式恒溫鏈置換核酸擴增方式。本發明所述的一種快速檢測SNP位點的熒光定量試劑盒靈敏度高，可以檢測到22aM的目標物，該方法選擇性好，有10000倍的錯配區分率，反應一步完成且為閉管反應，避免了交叉污染，同時反應所需時間短，無需熒光標記，可以直接檢測基因組樣品，節省了時間和人力成本。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，尤其是涉及一種快速檢測SNP位點的熒光定量試劑盒。

背景技術

基因多態性廣泛存在于生物體基因組中，其中單堿基多態性(SNP)是最常見的基因多態性形式。SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性，它是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，是基因突變的一種，主要是堿基置換突變，平均每500-1000個堿基對中就有1個，總數估計可達300萬個甚至更多。SNP可提供重要的遺傳數據，對于疾病的診斷、法醫鑒定分析有極其重要的意義。

目前，國內外現有的SNP檢測技術主要有以下幾種，基于芯片技術的檢測方法、高分辨率融解曲線檢測法，Taqman熒光探針法、等位基因特異性擴增法、質譜法和高效液相層析法等，其中等位基因特異性擴增法主要采用PCR擴增的方式，PCR循環擴增的過程中引物鏈延伸反應容易發生模板與引物之間的堿基錯配，導致合成的DNA片段不均一，PCR產物特異性較差。近幾年，一系列的基因突變的檢測方法層出不窮，同時經典的方法也在不斷地被改進，激活式引物恒溫鏈置換核酸擴增反應為聚合酶鏈式反應的一種特殊型式，在引物存在情況下，1小時內即可完成DNA或RNA的擴增反應，激活式引物恒溫鏈置換核酸擴增反應是一種在等溫條件下進行的高效率的核酸放大技術，這種技術只需要一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加之其有較高的靈敏度與專一性，非常適合應用于各種核酸檢測。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在提出一種快速檢測SNP位點的熒光定量試劑盒，以解決SNP位點檢測選擇性不高、靈敏度低、交叉污染等問題。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種快速檢測SNP位點的熒光定量試劑盒，包括包括SNP位點識別的第一類引物、協助第一類引物進行SNP特征序列恒溫擴增的第二類引物和第三類引物、核苷酸單體混合物、核糖核酸內切酶RNase H2、核酸聚合酶Bst DNA和核酸雙鏈熒光染料SYBR Green I的反應混合液，以及使用說明書。

進一步的，試劑盒的反應混合物包含pH值調節劑，使得所述反應混合物的pH值維持在7.5-9.5之間。

進一步的，試劑盒的反應混合物包含多種選擇下組的成分：包含Mg²⁺、K⁺、(NH₄)⁺、H⁺、Cl^-、SO^2-、Tris-Cl和細胞表面活性劑。

進一步的，試劑盒包含的引物的設計原則為：第一類引物、第二類引物和第三類引物分別與所述基因組DNA中目標堿基位點前后的一段或兩段序列一致或互補，條件是所述的第一類引物3’端序列與基因組DNA在目標堿基位點互補，并且所述的第一類引物中與目標堿基互補的堿基為核糖核苷酸，同時所述的第一類引物在3’端修飾有核酸聚合酶延伸反應阻斷基團，所述的第二類引物和第三類引物僅由脫氧核糖核酸組成并且3’端可被核酸聚合酶延伸。

進一步的，試劑盒包含的反應混合液中核糖核酸內切酶RNase H2、核酸聚合酶BstDNA與所述第一類引物、第二類引物和第三類引物可分別至于不同的獨立容器中。