[發明專利]一種微生物體內基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法

有效

• 申請號: 201811033458.1
• 申請日: 2015-07-03
• 公開（公告）號: CN109234295B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 郭道義;潘虹;李勛;李永東;范小林
• 申請（專利權）人: 贛南師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/55;C12P7/62
• 代理公司: 贛州智府晟澤知識產權代理事務所(普通合伙) 36128
• 代理人: 鄒圣姬

本發明公開了一種微生物內基于脂肪酸代謝途徑三個中間產物為前體分子合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法，其步驟為：首先通過微生物中高表達脂酰?ACP還原酶AAR、羧酸還原酶CAR、脂酰?CoA還原酶FAR及醛還原酶AHR，分別得到可還原脂酰?ACP、脂肪酸或脂酰?CoA產脂肪醇的工程菌。最后在產脂肪醇工程菌中高表達醇乙?；D移酶ATF1，用于催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成信息素脂肪醇乙酸酯。本發明可實現由葡萄糖到脂肪醇乙酸酯的微生物轉化，為大規模的生物合成脂肪醇乙酸酯提供了一個可行道路。

技術領域

本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及改造微生物代謝途徑，從單糖直接合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法。

背景技術

1、昆蟲性信息素，又稱性外激素(人工合成用于防治害蟲的又稱為性引誘劑)，是由同種昆蟲某一性別個體的特殊器官分泌于體外，能被同種異性個體的感受器所接受，并使其產生相應行為反應或生理效應(如覓偶、定向求偶、交配等)的微量化學物質。至今，已鑒定出約2000種昆蟲性信息素，大多數性信息素為各種脂肪醇乙酸酯分子。目前已有少數昆蟲性信息素實現了化學全合成。由于應用昆蟲性信息素進行害蟲監測和防治具有高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲等優點，國內外學者十分重視對昆蟲性信息素的研究和應用。

2、昆蟲性信息素是昆蟲本身的產物，因此其最大的優點就是使用非常安全，害蟲不產生抗性、靈敏度高、用量少、專屬性強、不污染環境、對天敵無害甚或有利，對生態環境的干擾小、不造成破壞。目前昆蟲性信息素被用于蟲情檢測、大量誘捕、干擾交配、配合治蟲、害蟲檢疫、區分近緣種等方面。但由于絕大多數的種類的昆蟲性信息素還未能實現商品化生產，限制了其更廣泛的應用。

3、目前已商品化的性信息素均為通過化學法合成。化學法合成性信息素需涉及到多個反應步驟導致合成成本較高。通過生物技術手段，實現微生物發酵單糖合成各種性信息素，可有效的降低成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種微生物體內基于脂肪酸合成脂肪醇乙酸酯的方法，在微生物內構建一條由單糖轉化到脂肪醇乙酸酯的代謝途徑。

為實現上述目的，本發明提供了在大腸桿菌合成脂肪醇乙酸酯的方法，合成示意圖如圖1所示，主要步驟為：

(1)構建基于脂肪酸為前體分子產脂肪醇乙酸酯工程菌

將來自Mycobacterium marinum菌的羧酸還原酶CAR基因和釀酒酵母醇乙?；D移酶ATF1基因，重組到載體pET28a(+)上，得到載體pDY10。將來自大腸桿菌的醛還原酶AHR及硫酯酶‘TESA基因、枯草芽孢桿菌磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶Sfp基因，重組到載體pBBR1MCS1上，得到載體pDY09。將上述兩個載體同時轉入到大腸桿菌中，實現上述五個基因在大腸桿菌中的高量表達，得到大腸桿菌工程菌株GDY4。表達‘TESA用于水解脂酰-ACP產生脂肪酸，表達CAR用于催化脂肪酸還原為脂肪醛，表達Sfp用于活化CAR酶，表達AHR用于隨后催化脂肪醛還原形成脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。脂肪酸和乙酰輔酶A均可由大腸桿菌發酵單糖或甘油合成，為此上述構建的GDY4工程菌可有效的將單糖或甘油轉化為脂肪醇乙酸酯。

相應的，還可以通過(2)構建基于脂酰-ACP為前體分子產脂肪醇乙酸酯工程菌

將來自Synechococcus elongates菌的脂酰-ACP還原酶AAR基因、大腸桿菌的醛還原酶AHR基因和釀酒酵母醇乙酰基轉移酶ATF1基因，重組到載體pET28a(+)上，得到載體pDY05。將該載體轉入到大腸桿菌中，實現上述三個基因在大腸桿菌中的高量表達，得到大腸桿菌工程菌株GDY2。表達AAR用于催化脂酰-ACP還原為脂肪醛，表達AHR用于隨后催化脂肪醛還原形成脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP和乙酰輔酶A均可由大腸桿菌發酵單糖或甘油合成，為此上述構建的GDY2工程菌可有效的將單糖或甘油轉化為脂肪醇乙酸酯。