[發明專利]無飼養細胞的胚胎干細胞的長期培養物

有效

• 申請號: 201811033235.5
• 申請日: 2005-05-20
• 公開（公告）號: CN109136173B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 徐仁和;J·A·湯姆森
• 申請（專利權）人: 威塞爾研究所股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

以前培養人胚胎干細胞的方法需要成纖維細胞飼養細胞或曾經接觸成纖維細胞飼養細胞的培養基以將干細胞維持在未分化狀態?，F在發現，如果在培養干細胞的培養基中加入骨形態發生蛋白拮抗劑和成纖維細胞生長因子，即便沒有飼養細胞或調理培養基，干細胞也將無限期地維持未分化。

相關申請的交叉參考

本申請要求2004年5月21日提交的美國臨時專利申請序列號60/573，545的優先權。

關于聯邦政府資助研究或開發的聲明

待定。

發明背景

干細胞被定義為能夠分化成許多其它分化細胞類型的細胞。胚胎干細胞是來自胚胎的干細胞，能夠分化成大多數，如果不是全部，成熟機體的分化細胞類型。干細胞被稱為是多能的，這是指它能夠分化成許多細胞類型。一類受到研究機構高度關注的多能干細胞是人胚胎干細胞，這里簡稱為hES細胞，這是一種來自人胚胎來源的胚胎干細胞。人胚胎干細胞由于能夠在培養基中無限增殖并由此而能夠(至少原則上能夠)提供細胞和組織以替代缺陷或受損的人組織而受到極大科學關注。培養物中存在人胚胎干細胞有可能提供無限量的人細胞和組織以用于各種有助于人體健康的治療方案?？梢韵胂?，在未來，將能夠增殖人胚胎干細胞并使其定向分化成特定譜系以產生出于治療目的可移植入人體的分化的細胞或組織。

人胚胎干細胞一個最重要的特征是能夠自我更新。這就意味著hES細胞能夠增殖成多種后代干細胞，其中每種似乎都具有其祖先細胞的全部潛能。換句話說，后代被更新而具有親本細胞的所有發育和增殖能力。這種特性以及多能性使得hES細胞可用于多種潛在用途，因為，從理論上說，hES細胞能夠無限大量復制且然后可誘導成為人體內的任何細胞類型。根據已有知識而言，只有未分化的hES細胞才能夠無限自我更新，一旦細胞分化就喪失了自我更新的能力，至少從這一角度看，能夠自我更新的特性似乎與保持未分化的特性密切相關。由于人胚胎干細胞將自發分化，因此培養時必需小心以維持細胞處于未分化狀態。

已經描述了產生和培養人胚胎干細胞以維持細胞處于未分化狀態的基礎技術?，F有技術的確有效，但一些目前用來培養人胚胎干細胞的方法有限制和缺點。一種限制意義特別重大。大多數現有人胚胎干細胞系在一定程度上或在其它程度上已經直接暴露于小鼠細胞或暴露于其中已經培養過小鼠細胞的培養基。最初的產生和培養人胚胎干細胞的技術要使用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養細胞作為飼養層，在該飼養層上可培養人胚胎干細胞。成纖維細胞飼養層通過一些仍不十分清除的機制使得干細胞能夠保持在未分化狀態。隨后發現，如果使干細胞接觸“調理培養基(conditioned medium)”也能獲得相同的現象。調理培養基無非就是已經培養過MEF等飼養細胞的干細胞培養基。無論飼養細胞是能賦予培養基某些因子還是能從培養基中除去某些因子，其結果都是調理培養基可用來培養干細胞使其不發生分化。無論是培養條件、直接在飼養細胞上生長還是使用調理培養基都涉及一種或多種能從小鼠細胞傳遞到人ES細胞的試劑，如病毒。如果培養人胚胎干細胞的一個目的是產生最終可植入人體的組織，就高度需要干細胞從而暴露于其它種類的細胞或者暴露于曾用來培養其它種類細胞的培養基。同時，使用任何種類的飼養細胞會在培養干細胞時帶來不需要的生物變異，而這是要盡可能避免的。因此，在利用人胚胎干細胞技術的持續發展中最感興趣的是找到能增殖和培養人胚胎干細胞但不含成纖維細胞飼養層且不含調理培養基的培養條件。

一些培養基配方能夠在一段時間內使人ES細胞維持未分化狀態，但長期培養時將不能維持這種狀態。具體地說，我們定義來自最初的種子培養物的人ES細胞在培養板上生長至細胞鋪滿一個“傳代”。我們發現一些培養基配方允許培養人ES細胞一或兩個傳代不發生嚴重分化，但在隨后的傳代中細胞逐漸或迅速分化。我們已經開始相信，為得到確實能夠支持人ES細胞無限增殖而不分化且不含飼養細胞或飼養細胞調理的培養基的培養基，培養基必需支持培養人ES細胞處于基本均勻且未分化狀態至少5代。

發明概述