[發明專利]一種人類阿司匹林抵抗基因多態性檢測試劑盒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811032152.4
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN109055530A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 晏星;李倩;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 徐曉琴

1.引物組，其特征在于，所述引物組由普通的外引物和帶熒光標簽的特異性的ARMs引物組成，具體序列如下：用于擴增PEAR1基因rs12041331位點的特異性引物序列如SEQ IDNO.1~ SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團，SEQ IDNO.4所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團；用于擴增GP1BA基因rs6065位點的特異性引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團，SEQ ID NO.8所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團；用于擴增GPIIIa rs5918位點的特異性引物序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12所示，其中SEQ ID NO.10所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團，SEQ ID NO.12所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團；用于內控的引物序列如SEQ IDNO.13~ SEQ ID NO.14所示。

2.探針組，其特征在于，所述探針組由特異性taqman-MGB探針和攜帶淬滅基團的鎖核酸探針組成，核苷酸序列如SEQ ID NO.15~ SEQ ID NO.17所示，具體形式如下：

內控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’

野生型淬滅基團鎖核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’

突變型淬滅基團鎖核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ 。

3.一種檢測試劑盒，包含權利要求1所述引物組和權利要求2所述探針組，其特征在于，所述試劑盒由分別用于擴增PEAR1、GP1BA、GPIIIa位點的PCR預混反應液、陽性對照品及陰性對照品組成；

所述PCR預混反應液的具體組分如下：

（1）用于擴增PEAR1基因位點的PCR預混反應液包括：所述用于擴增PEAR1基因rs12041331位點的引物，引物序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示；所述用于內控的引物序列，序列如SEQ ID NO.13~ SEQ ID NO.14所示；所述探針組，序列如SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.17所示；以及PCR反應液組成；

（2）用于擴增GP1BA基因位點的PCR預混反應液包括：所述用于擴增GP1BA基因rs6065位點的引物，引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示；所述用于內控的引物序列，序列如SEQ ID NO.13~ SEQ ID NO.14所示；所述探針組，序列如SEQ ID NO.15~ SEQ ID NO.17所示；以及PCR反應液組成；

（3）用于擴增GPIIIa基因位點的PCR預混反應液包括：所述用于擴增GPIIIa基因rs5918位點的引物，引物序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12所示；所述用于內控的引物序列，序列如SEQ ID NO.13~ SEQ ID NO.14所示；所述探針組，序列如SEQ ID NO.15~ SEQ IDNO.17所示；以及PCR反應液組成；

所述陽性對照包括：包含PEAR1基因rs12041331位點突變型質粒、PEAR1基因rs12041331位點野生型質粒、GP1BA基因rs6065位點野生型質粒、GP1BA基因rs6065位點突變型質粒、GPIIIa基因rs5918位點突變型質粒、GPIIIa基因rs5918位點野生型質粒及內參質粒DNA；

所述陰性對照包含不含內參基因和目的基因位點的重組質粒。

4.根據權利要求3所述檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR預混反應液中，探針組內taqman-MGB探針的濃度為50~100nM，攜帶淬滅基團的鎖核酸探針的濃度均為100~400nM；用于擴增各位點的不帶熒光基團的各引物濃度均為100~400nM，帶熒光基團的各引物濃度均為50~100nM；用于內控的引物的濃度均為100~400nM。

5.根據權利要求3所述檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括Premix qPCRmix和TE緩沖液。