[發明專利]一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統及方法

在審

• 申請號: 201811030915.1
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN109001900A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 閆鋒;楊程
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G02B21/06
• 分類號: G02B21/06;G02B21/36
• 代理公司: 江蘇法德永衡律師事務所 32305
• 代理人: 胡玲

1.一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，包括明場照明光源、熒光激發光源、顯微成像裝置和數據處理與顯示系統；所述顯微成像裝置包括樣品腔、熒光樣品、濾光片和圖像傳感器芯片，所述樣品腔用于裝載熒光樣品，樣品腔底部緊貼濾光片表面；所述濾光片用于阻擋激發光并同時透過激發出來的熒光信號，固定在圖像傳感器芯片的表面；所述圖像傳感器芯片，用于采集明場模態下待檢測樣品的整體形態信息以及熒光模態下的熒光樣品的亞細胞結構的熒光信號；所述明場照明光源作為明場成像模態下的照明光源，置于所述顯微成像裝置的上方，顯微成像裝置的中軸垂直穿過明場照明光源的發光面中心且該發光面覆蓋整個圖像傳感器芯片；所述熒光激發光源作為熒光成像模態下的熒光激發光源，用于激發出待檢測樣品中熒光信號，置于所述顯微成像裝置的側方，所述熒光激發光源照射方向與所述顯微成像裝置中軸之間的夾角為θ₁，且其發光面覆蓋所述圖像傳感器芯片表面；所述數據處理與顯示系統，用于將明場成像模態和熒光成像模態下圖像傳感器芯片記錄的圖像進行合成，并顯示出顯微成像結果。

2.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述明場照明光源為寬帶紅光LED燈珠，中心波長為λ₁，帶寬為Δλ₁＞5nm，距離圖像傳感器芯片表面的距離為d≥5cm。

3.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述熒光激發光源為窄帶光源，中心波長為λ₂，帶寬為Δλ₂≤5nm，夾角θ₁的取值：15°≤θ₁≤85°。

4.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述樣品腔底部直接粘附在濾光片表面，樣品腔設有入液口和出液口，樣品腔的腔體厚度d_c的值為：10μm≤d_c≤200μm。

5.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述熒光樣品是熒光染料標記的生物細胞樣品或者是熒光染料標記的微生物。

6.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述濾光片為高通濾光片，明場照明光源的波長大于濾光片的截止波長，熒光激發光源的波長小于明場照明光源的波長，熒光激發光源激發出的熒光信號波長大于濾光片的截止波長。

7.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述濾光片厚度d_F≤1μm，且直接粘附在圖像傳感器芯片表面。

8.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述圖像傳感器芯片采用CMOS圖像傳感器、半浮柵晶體管或者復合介質柵光敏探測器，單個像素單元的尺寸≤1μm×1μm，整個圖像傳感器芯片具有的像素數目≥1000萬。

9.根據權利要求1所述的一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統，其特征在于，所述數據處理與顯示系統顯示出熒光樣品既有明場又有熒光的顯微成像結果。

10.利用如權利要求1所述一種明場和熒光雙模態的顯微成像系統的方法，其特征在于，具體步驟如下：

第一步，將濾光片固定在圖像傳感器芯片表面，然后將樣品腔固定在濾光片表面，取適量熒光樣品注入到樣品腔中；

第二步，采用明場照明光源照射熒光樣品，明場照明光源波長λ₁大于濾光片截止波長λ₀，圖像傳感器芯片記錄下直接透過濾光片的待檢測樣品的投影信號；

第三步，關閉明場照明光源，采用熒光激發光源斜入射照射熒光樣品，激發出來的熒光信號波長為λ_s大于截止波長λ₀，熒光激發光源波長λ₂小于λ₀-Δλ₀，其中Δλ₀≤20nm，因此圖像傳感器芯片只能記錄下透過濾光片的熒光信號，而熒光激發光源的信號無法透過濾光片；

第四步，通過數據處理與顯示系統將明場模態下顯微圖像I₁和熒光模態下顯微圖像I₂進行合成，然后顯示出熒光樣品既有明場又有熒光的顯微成像結果I，通過人眼或者人工智能計算機觀察、識別及檢測；圖像合成的具體方法如下：

I＝I₁×m₁+I₂×m₂

其中系數m₁和m₂用于調節兩種模態的顯微圖像在合成后的顯微圖像I中占有的權重，0<m₁≤0.5，0<m₂≤0.5。