[發明專利]一種基于TdT和DNAzyme擴增的黃瓜綠斑駁病毒可視化檢測方法

有效

• 申請號: 201811029387.8
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN109182598B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 王瑩;何茂華
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6816
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙) 11670
• 代理人: 劉亞娟

1.一種基于脫氧核苷酸末端轉移酶TdT和DNAzyme擴增的黃瓜綠斑駁病毒可視化檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將T1和P1混合在NEB CutSmart緩沖溶液中，在37℃下雜交；

(2)加入內切酶AcⅡ，利用AcⅡ識別5′-AACGTT-3′位點，在37℃下持續反應一定時間，獲得酶切產物，37℃下解鏈為4個ssDNA片段；

(3)取一定量的所述酶切產物，加入TdT和dCTP于磷酸鹽緩沖溶液中混合，在37℃下進行加尾反應，升溫至85℃滅活3min，獲得Mg²⁺-依賴的DNAzyme的完整酶序列；

(4)加入HP和含Mg²⁺緩沖液，在37℃下孵育100min，Mg²⁺-依賴的DNAzyme的完整酶序列與HP進行雜交，在Mg²⁺存在下，Mg²⁺-依賴的DNAzyme剪切HP的識別位點，將HP剪切為兩部分；

(5)加入一定濃度的Hemin和含K⁺緩沖液，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G-四連體結構溶液；

(6)最后依次在Hemin/G-四連體結構溶液中加入一定濃度的ABTS^2-和H₂O₂溶液，室溫下反應一段時間，得到綠色溶液；

所述T1的基因序列如SEQ ID No.1所示，P1的基因序列如SEQ ID No.2所示，HP的基因序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.1：AACCCGAACGTTTG，SEQ ID No.2：ACACACAGCGATCACCCATGTTAAACGTTCGGGTT，SEQ ID No.3：TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC；

步驟(1)中所述P1濃度為1.0μM；

步驟(4)中所述HP濃度為1.0μM；

步驟(2)中所述AcⅡ的酶切反應時間為50min；

步驟(3)中所述加尾反應時間為30min；

步驟(4)中所述Mg²⁺-依賴的DNAzyme和HP的雜交時間為100min。