[發明專利]脫氧膽酸鈉沉淀法檢測Hib結合疫苗中游離多糖的方法

在審

• 申請號: 201811020769.4
• 申請日: 2018-09-03
• 公開（公告）號: CN109001198A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 曹方;朱復培;王良超;李強;馬偉;嚴世鑫;楊歡;胡文龍;王磊
• 申請（專利權）人: 艾美衛信生物藥業（浙江）有限公司
• 主分類號: G01N21/82
• 分類號: G01N21/82;G01N1/28
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 黃勇

本發明公開了一種脫氧膽酸鈉沉淀法檢測Hib結合疫苗中游離多糖的方法，屬于疫苗檢測技術領域，其技術方案要點是，包括供試品預處理、游離多糖溶液的收集、核糖濃度的測定以及計算供試品中多糖含量以及游離多糖的含量的操作步驟，其先利用超濾法去除蔗糖，再利用脫氧膽酸鈉沉淀多糖蛋白結物，從而準確的對Hib結合疫苗中的游離多糖含量加以測定，降低了Hib結合疫苗的生產成本。

技術領域

本發明屬于疫苗檢測技術領域，特別涉及一種脫氧膽酸鈉沉淀法檢測Hib結合疫苗中游離多糖的方法。

背景技術

流感嗜血桿菌是一類革蘭氏陰性小桿菌，其可根據莢膜多糖組成和抗原性分為a、b、c、d、e、f型，b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzzae Type b，Hib)致病力最強，與大多數嚴重局部感染和侵襲性感染有關。

Hib結合疫苗是利用純化的Hib莢膜多糖與破傷風類毒素共價結合而成的多糖蛋白結合物，該多糖蛋白結合物能夠引起機體胸腺依賴性免疫應答，其成功研制為預防如腦膜炎、肺炎等侵襲性Hib疾病提供了重要的工具。

在Hib結合疫苗生產過程中，以Hib莢膜多糖為主的游離多糖因其為T細胞非依賴性抗原，不但在再次免疫時不能使機體誘導免疫記憶應答，而且還會對Hib結合疫苗的穩定性和效力造成影響，因此該游離多糖通常作為雜質而被去除，并在Hib結合疫苗的原液和成品檢測中將游離多糖含量的測定作為重要質量控制指標，以便于監控Hib結合疫苗在生產過程中游離多糖的去除效果。

目前，測定游離多糖含量的方法較多，其中脫氧膽酸鈉(Sodium desoxycholate，DOC)沉淀法具有操作簡單、重現性好、結果可靠等優點而被廣泛應用。其工作原理為：脫氧膽酸鈉在酸性條件下形成膠團，能夠將蛋白物質加以沉淀，進而達到Hib結合疫苗中的多糖蛋白結合物與游離多糖分離的目的；最后再利用Hib結合疫苗中的游離多糖在酸性條件下易水解生成核糖的特點，該游離多糖的含量通過檢測其水解所得的核糖含量來測定。

然而，Hib結合疫苗在結合原液制成成品的生產過程中還添加有蔗糖等賦形劑，以降低多糖蛋白結合物在凍干時被破壞的可能性，而蔗糖由一分子葡萄糖的半縮醛羥基與一分子果糖的半縮醛羥基彼此縮合脫水而成，其通過水解容易生成具有還原性的葡萄糖和果糖，進而對游離多糖的測定有較強的干擾，造成檢測得到的游離多糖含量比實際高，從而導致Hib結合疫苗在制備過程中為達到檢測標準而花費更多的人力物力，使得其生產成本較高。因此，目前急需一種檢測精確度高的用于檢測Hib結合疫苗中游離多糖的方法。

發明內容

針對以上現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種高精確度的檢測Hib結合疫苗中游離多糖的方法，其中，本發明的發明人創造性的在進行脫氧膽酸鈉處理前，先用超濾法去除蔗糖，以此減少Hib結合疫苗中蔗糖的含量，再利用脫氧膽酸鈉沉淀多糖蛋白結物，從而準確的對Hib結合疫苗中的游離多糖含量加以測定，降低了Hib結合疫苗的生產成本。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：

一種脫氧膽酸鈉沉淀法檢測Hib結合疫苗中游離多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

一、供試品預處理：

①結合原液預處理：取適量原液用滅菌注射用水按標示量稀釋，即得結合原液的供試品溶液；②成品預處理：取適量成品用滅菌注射用水按標示量溶解，取4.0ml于超濾離心管中，在溫度為4℃、轉速為7000-9000r/min的條件下超濾離心8-12min，收集濃縮液，補滅菌注射用水至總體積為4ml，重復8-10次上述在超濾離心后補滅菌注射用水的操作，吹打混勻后即得成品的供試品溶液；

二、游離多糖溶液的收集：量取步驟一中的結合原液或成品的供試品溶液，加入脫氧膽酸鈉溶液，充分混勻后冰浴20-40min，再加入鹽酸溶液，混勻后低溫離心20-40min，收集上清液為游離多糖溶液；