[發明專利]一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法

在審

• 申請號: 201811020621.0
• 申請日: 2018-09-03
• 公開（公告）號: CN109112153A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 程奇;孫文麗
• 申請（專利權）人: 浙江善測禾騎士生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)獲得突變的LPOR-Y193F cDNA序列

設計LPOR cDNA Y193F突變引物，利用KOD Plus mutagenesis kit獲得突變的LPOR-Y193F cDNA序列為SEQ ID NO 1；其中LPOR cDNA Y193F突變引物為

Y193FN 5’-GCAAGGCCTTCAAAGACAGCATGCTCAGCAATATGCTG-3’；SEQ IDNO 2；

Y193FC 5’-GTCTTTGGCGGCCTTGCCCGACTTGAAGGGCTTACCG-3’；SEQ IDNO 3；

(2)表達載體構建

將得到的所述LPOR-Y193F cDNA克隆到原核表達載體pE-SUMO3中，得到pE-SUMO3-LPOR-Y193F；

(3)LPOR-Y193F突變體蛋白表達

將所述pE-SUMO3-LPOR-Y193F轉入大腸桿菌BL21細胞中，并于25-37℃，培養3-5小時，直到OD₆₀₀達到0.8，加入誘導劑于25-30℃，培養3-6小時，得到菌體懸液；

(4)LPOR-Y193F突變體蛋白分離

將步驟3得到的所述菌體懸液進行離心并棄上清液，將得到的菌體重懸于冰浴的溶液A中，得到懸濁液；將所述懸濁液進行均質后離心，得懸濁液上清液，并將所述懸濁液上清液經0.44um的濾膜過濾后，上樣5-ml HiTrap FF原油柱，利用溶液B按咪唑濃度梯度洗脫；

(5)LPOR-Y193F突變體蛋白純化

收集步驟(4)洗脫下來的蛋白峰，加入SENP2蛋白酶，切掉SUMO尾巴，然后利用溶液C進行透析；隨后，蛋白上樣5-ml Hitrap Q HP柱，洗脫溶液為0.05–0.5MNaCl梯度洗脫液；回收蛋白峰，過Superdex 75分子篩柱子，得到LPOR-Y193F突變體蛋白；

(6)LPOR-Y193F突變體蛋白結晶

將(5)得到的所述LPOR-Y193F突變體蛋白濃縮至26-30mg/ml，隨后濃縮蛋白在蛋白點晶池液中生長1周；挑取晶體在防凍保護液中浸泡5-10s，隨即放入液氮管中保存，得到所述LPOR-Y193F突變體蛋白結晶。

2.根據權利要求1所述的一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述誘導劑為0.3mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

3.根據權利要求1所述的一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述溶液A由20mM Tris-HCl，0.3MNaCl和20mM咪唑組成，其pH為7.4。

4.根據權利要求1所述的一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述懸濁液均質方法為利用高壓均質機破碎，8000壓力，破碎3次，每次3分鐘。

5.根據權利要求1所述的一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述溶液B由20mM Tris-HCl，0.3MNaCl和0.02–0.3M咪唑組成，其pH為7.4。

6.根據權利要求1所述的一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述溶液C由20mM Tris-HCl和0.05MNaCl組成，其pH為7.4。

7.根據權利要求1所述的一種LPOR-Y193F突變體蛋白晶體的制備方法，其特征在于，步驟(6)所述LPOR-Y193F突變體蛋白濃縮方法為，利用濃縮緩沖液在30KD的蛋白濃縮管中進行濃縮；所述濃縮緩沖液包括20mM Tris-HCl和150mMNaCl。