[發明專利]有效鑒別不同種類中華鱉的分析檢測方法

有效

• 申請號: 201811009612.1
• 申請日: 2018-08-31
• 公開（公告）號: CN108918725B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 沈清;俞喜娜
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.有效鑒別不同種類中華鱉的分析檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、取待測中華鱉的肌肉組織0.2g，碾磨均勻后加入1.2±0.1mL二氯甲烷-甲醇混合提取溶液，于30±5℃振蕩均勻，得提取液；

所述二氯甲烷-甲醇混合提取溶液中，二氯甲烷：甲醇＝1.9～2.1：1的體積比；

2)、將提取液進行超聲輔助提取后，加入0.8±0.1mL的超純水，然后冷凍離心；

3)、在步驟2)冷凍離心所得的首次水相中加入2±0.2mL二氯甲烷進行二次提取，獲得位于上層的二次水相和位于下層的二次有機相層；

4)、步驟2)冷凍離心所得的首次有機相以及步驟3)二次提取獲得的二次有機相進行合并，得萃取液；

將萃取液放置在氮吹儀下吹干，用1mL的乙腈定容，過0.22μm有機濾膜，作為待測液；

5)、將待測液通過液相色譜質譜法進行分析檢測，利用m/z790,816,818和866的磷脂離子作為潛在標記物用于中華鱉種類鑒別；

液相色譜為：液相色譜柱為YMC Triart diol液相色譜柱，4.6*250mm，3μm；色譜柱溫度為40℃，流速為0.2mL·min^-1，進樣量為2mL；

流動相A為：先配乙酸濃度為53±5mM的乙酸乙腈溶液，再調pH至4.0～4.5；

流動相B為：在60±5mmol乙酸銨和53±5mmol乙酸中加入純水定容至1L，并調pH至3.0±0.2；

梯度洗脫為：0-3分鐘，流動相A保持在95％；3-13分鐘，流動相A由95％均勻降至70％；13-18分鐘，流動相A均勻下降至50％；梯度洗脫中，每個時間段內，余量為流動相B，上述％為體積％；

質譜條件為：在負離子模式下將離子噴霧電壓設置在4500V，離子源溫度保持在500℃；離子源氣體，包括干燥氣體(GS1)、霧化器氣體(GS2)和氣簾氣分別設置為50psi、60psi和25psi；質譜測量范圍為m/z450-950，掃描速率為每個光譜1s；

使用Analyst1.5.1軟件進行儀器控制和數據采集、處理和分析；

當m/z816的磷脂離子豐度的相對范圍在15％-21％，而且m/z790的磷脂離子豐度的相對范圍在2％-4％，m/z818的磷脂離子豐度的相對范圍在10％-12％時，待測中華鱉為浙烏二號；

當m/z816的磷脂離子豐度的相對范圍在6％-10％時，待測中華鱉為清溪烏鱉；

當m/z816的磷脂離子豐度的相對范圍在11％-14％時，待測中華鱉為浙新花鱉。

2.根據權利要求1所述的有效鑒別不同種類中華鱉的分析檢測方法，其特征在于所述步驟5)中，

質譜測定方式：使用針泵注射器以200μL·min^-1的流速，進樣量為2μL將步驟4)所得的待測液注入大氣壓離子化學源中，以負離子的方式進行電離。

3.根據權利要求1或2所述的有效鑒別不同種類中華鱉的分析檢測方法，其特征在于所述步驟4)中：于4±1℃的環境溫度下，將萃取液用氮氣流吹干，然后再用1mL的乙腈定容，過0.22μm有機濾膜，作為待測液。

4.根據權利要求1或2所述的有效鑒別不同種類中華鱉的分析檢測方法，其特征在于：

所述步驟2)中：將提取液于提取溫度為50℃，53KHz的條件下超聲輔助提取30±5分鐘后，加入0.8±0.1mL的超純水，于-20±2℃下冷凍離心15±2分鐘。

5.根據權利要求1或2所述的有效鑒別不同種類中華鱉的分析檢測方法，其特征在于所述步驟3)中：在步驟2)離心所得的首次水相中加入2±0.2mL二氯甲烷進行二次提取，獲得位于上層的二次水相和位于下層的二次有機相層；以二次水相替代步驟2)離心所得的首次水相重復上述二次提取1～2次；

步驟2)離心所得的首次有機相以及步驟3)所有的提取獲得的二次有機相進行合并，得萃取液。