[發明專利]一種利用碳量子點染色的凝膠電泳檢測古代毛織品的方法

有效

• 申請號: 201811000722.1
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN109060927B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 王秉;王鐘元;楊慧;朱誠;彭志勤;胡智文
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/30;G01N1/34;G01N1/44;G01N1/28;G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙) 33265
• 代理人: 侯蘭玉

1.一種利用碳量子點染色的凝膠電泳檢測古代毛織品的方法，其特征在于，以g和mL計，包括如下步驟：

1）向15-30 mL正庚烷中加入摩爾比為18-22:1的水和十二烷基苯磺酸鈉，制得油相溶液；

2）向步驟1）所得油相溶液中，加入質量分數為45-55%的生物質焦油水溶液，再加入摩爾比為1.8-2.2:1的正丙醇和十二烷基苯磺酸鈉，用力搖晃，溶液變淡黃色，得到反相微乳液，于室溫靜置10-13h；

3）向步驟2）所得反相微乳液中加入0.2-0.4 g十二胺，室溫下超聲8-12 min；然后向含聚四氟乙烯內膽的反應釜內倒入超聲后的混合溶液，在110-130℃馬弗爐中放置2-4 h，取出，自然冷卻至室溫；用無水甲醇破乳，洗滌數次，離心，制得碳量子點原始溶液；

4）用酒石酸將0.03-0.06 mol/L的酒石酸鈉溶液的pH調為2.5-2.8，將此溶液與350-450μl步驟3）所得碳量子點原始溶液混合均勻，制得碳量子點染膠溶液；

5）稱取古代毛織品樣品，用去離子水反復清洗，去除表面污漬，放入30-35℃真空烘箱烘干；

6）將步驟5）洗凈烘干的樣品，加入pH =1.5-2.5的HBr溶液，靜置1-2h，用去離子水搓洗至中性，30-35℃真空烘干；

7）將步驟6）烘干的樣品，以1：15-25的浴比加入含有0.05-0.15mol/L的LiBr和0.02-0.04mol/L的十二烷基硫酸鈉的溶液中浸沒，調節pH值到8-11，室溫下以190-210W的功率超聲30-50min后，放入微波反應器輻射水解6-8min；

8）從反應器中取出，倒入三口燒瓶，將三口燒瓶置于恒溫水浴鍋中，調節水浴溫度70-90℃，通氮氣10-20分鐘，排除氧氣，緩緩加入10-25ml的2.5-3.5 mol/L 三(2-羧乙基)膦溶液，通氮氣攪拌，使羊毛溶解，真空抽濾，去除未溶羊毛及雜質；

9）加入20-35g硫酸銨，攪拌均勻，調節濾液pH，離心8-15min，將下層溶液在2-6℃條件下用透析袋透析，前9-12h，每隔1-2h換一次水，第12- 24h每隔2-5h換一次水，第24-48h每隔5-10h換一次水，第48-72h，每隔10-15h換一次水，除去表面活性劑、金屬鹽雜質；低溫真空濃縮至原體積的1/4-1/2，得到羊毛角蛋白提取液；

10)組裝制膠器，灌注分離膠，加入純化水，待分離膠的膠面與水形成可見的界面時，輕輕倒出純化水，擦干純化水后插上梳子，注入濃縮膠；待濃縮膠完全聚合后，將梳子輕輕拔出；

11)取羊毛角蛋白提取液與2×樣品緩沖液按1∶0.8-1.2比例混合，水浴加熱于93-97℃下加熱1.5-2.5 min，使蛋白質變性并確保結合最大量的十二烷基硫酸鈉；樣品冷卻至室溫后，取羊毛角蛋白提取液10-20μl加入凝膠點樣孔，進行SDS-PAGE凝膠電泳；

12)電泳完畢后，切斷電源，取出凝膠，浸入步驟4）所得碳量子點染膠溶液，以低速在搖床上振蕩2.5-3.5h，放到凝膠成像儀中，觀察樣品的電泳圖像；

13)將經步驟12)所得染色樣品的蛋白質條帶割下并裝入1.0-2.0ml離心管中，加入300-400ul去離子水振蕩洗滌，吸出液體，重復一次，加入含10-30％甲醇、4-8%甘油、8-12％乙酸的脫色液40-70ul，靜置2-4min，用去離子水終止反應并重復洗滌一次，吸出多余的液體；加入180-220ul 35-45mmol/L碳酸氫銨溶液振蕩洗滌2-4min，重復一次；加入110-160ul乙腈振蕩，待膠塊變白，吸棄乙腈，置于真空濃縮儀中干燥8-12min；

14)向步驟13)所得的離心管中加入50-80ul的胰蛋白酶溶液，完全蓋住膠粒冰浴40-50min，使膠粒吸收酶解液溶脹，然后在35-40℃烘箱中孵育13-15h進行酶解；

15)采用HPLC-MS/MS對其進行質譜分析，根據質譜檢測得到的氨基酸序列與氨基酸序列數據庫對比得到古代毛織品是否屬于羊毛的結論。

2.如權利要求1所述的一種利用碳量子點染色的凝膠電泳檢測古代毛織品的方法，其特征在于，步驟8）中，通氮氣攪拌具體為向三口燒瓶中持續通入氮氣，利用機械攪拌以180-220r/min的速度攪拌1.8-2.2 h至羊毛溶解，溶液變澄清。