[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌及合成四氫嘧啶的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810996222.1
• 申請(qǐng)日: 2018-08-29
• 公開（公告）號(hào): CN109182236A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王鴻;陳俊;儲(chǔ)消和;柳鵬福;陳建偉;章華偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脫羧酶lysA基因敲出，并導(dǎo)入核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示四氫嘧啶合成基因簇ectABC獲得的。

2.如權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述四氫嘧啶合成基因簇ectABC先與pTrc99a質(zhì)粒連接，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌獲得的。

3.一種權(quán)利要求1重組大腸桿菌在轉(zhuǎn)化合成四氫嘧啶中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑加入轉(zhuǎn)化液中，在25-45℃、150-200rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)6-48h，反應(yīng)結(jié)束，獲得四氫嘧啶；所述轉(zhuǎn)化液終濃度組成：L-天冬氨酸鈉5-80g/L，甘油5-80g/L，氯化鉀0-50g/L，溶劑為PBS緩沖溶液，pH6.0-8.0。

5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌體用量以轉(zhuǎn)化液體積計(jì)為4-7g/L。

6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于濕菌體發(fā)酵方法為：將重組大腸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在28-37℃、150-200rpm條件下震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，再加入終濃度50mg/mL的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在28-37℃、150-200rpm條件下震蕩培養(yǎng)8-12h，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，獲得濕菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成：酵母提取物5-20g/L，胰蛋白胨5-15g/L，氯化鈉10-50g/L，溶劑為去離子水，pH7.0-7.3。

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌體在發(fā)酵前先進(jìn)行種子培養(yǎng)，再將種子液以體積濃度5-10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)方法為：將重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在28-37℃、150-200rpm條件下震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成：酵母提取物5-20g/L，胰蛋白胨5-15g/L，氯化鈉10-50g/L，溶劑為去離子水，pH7.0-7.3。

8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化液終濃度組成：L-天冬氨酸鈉10g/L，甘油10g/L，氯化鉀10g/L，溶劑為PBS緩沖溶液，pH6.5。

9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，溶劑為去離子水，pH7.0。

10.一種權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌(Escherichia coli)Hect，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)：GDMCC NO.60398，保藏日期2018年6月28日，地址：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓廣東省微生物研究所，郵編：510075。