[發(fā)明專利]一種以多孔納米金為載體固定脂肪酶的制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810993280.9
• 申請(qǐng)日: 2018-08-29
• 公開（公告）號(hào): CN108866037A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊曉寧;黃曉波;劉曉曄;王永康;張孟;唐賓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 太原理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14
• 代理公司: 太原市科瑞達(dá)專利代理有限公司 14101
• 代理人: 申艷玲

本發(fā)明公開了一種以多孔納米金為載體固定脂肪酶的制備方法和應(yīng)用，所述制備方法采用去合金化法制備多孔納米金材料，首先用α?硫辛酸修飾，形成羧基化的納米金材料；再用偶聯(lián)劑對(duì)其修飾，形成以N?羥基硫代琥珀酰亞胺為終端的納米金復(fù)合物，將豬胰脂肪酶固定在納米金復(fù)合物上形成固定化酶。本發(fā)明所得到的固定化酶具有良好的催化活性、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性相比游離酶具有明顯提高，且載體經(jīng)過簡(jiǎn)單處理后可循環(huán)利用，從而降低成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以多孔納米金為載體固定脂肪酶的制備方法和應(yīng)用，屬于生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脂肪酶因其在油脂水解、酯交換、脂反應(yīng)等催化反應(yīng)中表現(xiàn)出來(lái)較高的選擇性，在食品加工、醫(yī)藥、傳感器等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。然而，游離酶因其穩(wěn)定性差、與產(chǎn)物難以分離、無(wú)法循環(huán)使用等缺點(diǎn)阻礙了其在工業(yè)生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。將游離酶通過物理或化學(xué)的方法固定在特殊的載體上，在保持其天然活性的基礎(chǔ)上還可以提高其熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，此外，與特殊功能載體的結(jié)合還可以滿足其在生物等領(lǐng)域特殊功能化的需要。

隨著固定化技術(shù)研究的不斷發(fā)展，從最初的天然高分子材料到合成高分子材料、無(wú)機(jī)材料以及現(xiàn)在的復(fù)合材料等多種載體已被成功用于酶的固定化。近年來(lái)，多孔納米材料作為一種新的固定化酶載體引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種以多孔納米金為載體固定脂肪酶的制備方法，確定了脂肪酶固定化的條件，通過本方法，使脂肪酶的pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性均比自由酶明顯提高，固定化脂肪酶載體經(jīng)硝酸簡(jiǎn)單處理可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，操作簡(jiǎn)便從而使成本降低。

本發(fā)明還提供了上述以多孔納米金為載體的固定化酶的應(yīng)用，對(duì)比了固定化酶和游離酶的酶學(xué)特性。

本發(fā)明提供了一種以多孔納米金為載體固定脂肪酶的制備方法，采用去合金化法制備多孔納米金材料，首先用α-硫辛酸修飾，形成羧基化的納米金材料；再用偶聯(lián)劑對(duì)其修飾，形成以N-羥基硫代琥珀酰亞胺為終端的納米金復(fù)合物，將豬胰脂肪酶固定在納米金復(fù)合物上形成固定化酶。

本發(fā)明采用去合金化法制備多孔納米金，并用硫辛酸修飾，再用碳化二亞胺與N-羥基硫代琥珀酰亞胺修飾，然后將脂肪酶固定在載體上形成固定化酶。

上述制備方法具體包括以下步驟：

（1）多孔納米金材料的制備

將金銀合金材料放置于68-85%濃硝酸中腐蝕15-24 h，超純水清洗試樣，洗至中性，真空冷凍干燥機(jī)干燥；200-400℃退火2-3 h，得到孔徑為25-100 nm的納米金材料（NPG）；

（2）α-硫辛酸修飾多孔納米金材料表面

將α-硫辛酸固體溶于乙醇溶液，充分?jǐn)嚢杌旌铣苫旌弦海缓蠹尤氩襟E（1）制備的多孔納米金材料，常溫混合反應(yīng)15-24 h；用緩沖液沖洗3-6遍，干燥得到表面修飾羧基化的納米金材料；

（3）偶聯(lián)劑修飾羧基化的納米金材料

取步驟（2）中制備的羧基化的納米金材料與碳化二亞胺（EDC）和 N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）溶液常溫混合反應(yīng)4-12 h，繼續(xù)使用緩沖液沖洗，冷凍干燥后得到以NHS為終端的納米金復(fù)合物；

（4）納米金載體共價(jià)固定脂肪酶

將步驟（3）中制得的納米金復(fù)合物與脂肪酶溶液混合反應(yīng)，將得到的固定酶洗滌，干燥，得到脂肪酶納米金復(fù)合物（lipase-NPG）。

步驟（1）中金銀合金原子質(zhì)量比為48:52或50:50，濃硝酸濃度為68%-85%，腐蝕時(shí)間為15-24 h，200-400℃退火2-3小時(shí)，多孔納米金的孔徑為25-100 nm。