[發(fā)明專利]一種還原酶的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810992902.6
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN108998440A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜琳;杜偉;張翔;向世明;宋立波;杜燁;彭捷;黃清東
• 申請（專利權(quán)）人: 四川百特芳華醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N11/18
• 分類號: C12N11/18;C12N11/10;C12N11/04;C12N9/04
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本發(fā)明公開的是一種還原酶的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中固定化酶的穩(wěn)定性依然不高的問題。本發(fā)明包括將醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶混合后加入海藻酸鈉水溶液中，攪拌混勻后，攪拌下再將混合液滴加入CaCl₂水溶液中，滴加結(jié)束后，4℃冰箱內(nèi)靜置，蒸餾水洗滌，真空抽濾，獲得固定化顆粒；所述醛酮還原酶與葡萄糖脫氫酶質(zhì)量比為1:0.5～3.5，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉與醛酮還原酶質(zhì)量比為30～170：1；其特征在于，所述海藻酸鈉水溶液中還加入有聚乙二醇。本發(fā)明通過在海藻酸鈉水溶液中混合聚乙二醇，能有效提高固定化酶的穩(wěn)定性，效果十分顯著。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶制備領(lǐng)域，具體涉及的是一種還原酶的制備方法。

背景技術(shù)

酶作為一種生物催化劑，因其專一性強、催化效率高和作用條件溫和等特性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等方面。但天然酶穩(wěn)定性差，除了一些耐高溫的酶及少數(shù)可以耐受較低pH條件的酶以外，大多數(shù)酶在高溫、強酸、強堿條件下都容易變性失活；反應(yīng)結(jié)束后酶與產(chǎn)物混合，不能重復(fù)利用，產(chǎn)物分離純化困難；同時，酶的一次性使用，大大提高了生產(chǎn)成本，不利于連續(xù)化生產(chǎn)，限制了酶在工業(yè)上更廣泛的應(yīng)用。基于上述情況，固定化酶的概念得以提出，近年來，酶的固定化技術(shù)得到了不斷發(fā)展，在綜合不同固定化技術(shù)的基礎(chǔ)上，又出現(xiàn)了酶的共固定化技術(shù)，目前，酶的共固定化技術(shù)在臨床診斷、發(fā)酵過程控制及生物傳感器制備等方面都發(fā)揮著重要作用。

酶的固定化，是指采用物理或化學(xué)方法，將酶與水不溶性載體相結(jié)合的技術(shù)。固定化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有穩(wěn)定性增強，可反復(fù)或連續(xù)使用及易于和產(chǎn)物分離的顯著優(yōu)點。酶的共固定化即將不同來源的幾種酶或酶與某一完整細(xì)胞同時固定在同一個載體上，不僅使不同酶及細(xì)胞的各自優(yōu)勢得到充分發(fā)揮，而且將不同酶與細(xì)胞的生物催化性能結(jié)合起來。酶的固定化方法分為四類：吸附法，包埋法，結(jié)合法以及交聯(lián)法。

醛酮還原酶作為一類NAD(P)H依賴的氧化還原酶，具有廣泛的底物特異性，可將脂肪族醛酮、芳香族醛酮、類固醇等很多羰基化合物還原成相應(yīng)的醇類，在手性藥物及藥物中間體合成領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。利用醛酮還原酶催化4-氯-3-羰基乙酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-oxobutanoate,COBE)不對稱還原合成的(R)-或(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate,CHBE)，是多種藥物活性成分如(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯、L-肉毒堿、大環(huán)內(nèi)酯A和(R)-γ-氨基-β-羥基丁酸(GABOB)等合成的關(guān)鍵中間體，具有重要的應(yīng)用價值。

目前催化反應(yīng)使用的酮還原酶多是游離酶或全細(xì)胞，雖操作簡單，但催化過程中所需輔因子NAD(P)H價格比較昂貴，且酶無法重復(fù)利用，生產(chǎn)成本偏高，限制了酶催化方法的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。

對比文件CN201510351160.5公開了一種醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶的固定化方法,其達(dá)到了規(guī)模化生產(chǎn)且酶可以重復(fù)利用的目的，但是使用過程中固定化酶的穩(wěn)定性依然不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中固定化酶的穩(wěn)定性依然不高的問題；提供解決上述問題的一種還原酶的制備方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種還原酶的制備方法，包括：

將醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶混合后加入海藻酸鈉水溶液中，攪拌混勻后，攪拌下再將混合液滴加入CaCl₂水溶液中，滴加結(jié)束后，4℃冰箱內(nèi)靜置，蒸餾水洗滌，真空抽濾，獲得固定化顆粒；所述醛酮還原酶與葡萄糖脫氫酶質(zhì)量比為1:0.5～3.5，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉與醛酮還原酶質(zhì)量比為30～170：1；

所述海藻酸鈉水溶液中還加入有聚乙二醇。

本發(fā)明通過在海藻酸鈉水溶液中混合聚乙二醇，能有效提高固定化酶的穩(wěn)定性，效果十分顯著。