[發明專利]一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法

在審

• 申請號: 201810990342.0
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN109055515A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 楊天燕;孟瑋;高天翔
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6888
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)采用酚-氯仿法分別提取北方須鰍組織的基因組DNA；

2)設計線粒體COI基因的引物；

3)以兩種魚的DNA為模板，進行PCR擴增；

4)PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選條帶清晰的PCR產物進行測序；

5)計算得到北方須鰍與其隱存種之間的K2P遺傳距離，基于K2P遺傳距離構建鄰接系統關系樹，且對獲得的序列進行比對。

2.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述步驟1用北方須鰍組織取自尾鰭組織。

3.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述酚-氯仿法為改良酚-氯仿法。

4.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述改良酚-氯仿法用組織提取液含有10mM Tris-Cl、0.1M EDTA、0.32mMDTE、0.04mM BJ-BR、0.5％SDS；所述組織提取液的pH為7.8。

5.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述設計線粒體COI基因的引物的具體步驟為：從Genbank數據庫中下載北方須鰍的rDNA序列，對這些序列進行多重比對，分別在3’端和5’端找出比較保守的序列以及變異較大的區域，并在兩端保守的COI上設計擴增線粒體COI基因的引物。

6.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述線粒體COI基因的引物序列為：

FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；

FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’。

7.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述步驟3中PCR擴增反應總體積50μL，其中10×buffer 5.0μL，Mg²⁺終濃度為2.0mM，2.5mM dNTP 4μL，Taq聚合酶2units，10μM引物各2μL，1μg DNA模板2μL，加滅菌水至終體積50μL。

8.根據權利要求1所述的一種鑒別新疆額爾齊斯河北方須鰍隱存種的分子生物學方法，其特征在于：所述步驟3中PCR擴增反應條件為：95℃預變性5min，然后是35個循環，每個循環包括94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。