[發明專利]一種用于外泌體單分子定位超分辨成像的重組質粒和細胞株及其應用

在審

• 申請號: 201810988267.4
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN109182362A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 肖義;李寧;葉智偉;陳令成;張新富
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N5/10;G01N21/64
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

本發明公開了一種用于外泌體單分子定位超分辨成像的重組質粒和細胞株及其應用，把具有光激活性質的熒光蛋白基因和外泌體膜上標志性CD63蛋白基因進行融合構建成重組質粒，通過脂質體介導的質粒轉染技術轉染Hela細胞，通過藥物篩選獲得能夠穩定表達光激活熒光蛋白標記的外泌體的Hela細胞。借助于光激活熒光蛋白，進行分離純化的外泌體以及細胞內CD63蛋白分布的單分子定位的超分辨成像研究。與傳統顯微鏡相比，單分子定位的超分辨成像提供更好的空間分辨率，實現了有活性的外泌體單分子定位顯微成像，同時也實現了細胞內CD63蛋白分布的單分子定位成像研究。

技術領域

本發明屬于生物標記技術領域，具體涉及一種用于外泌體單分子定位超分辨成像的重組質粒和細胞株的制備方法及其應用。

背景技術

外泌體是細胞經過“內吞-融合-外排”過程而形成的細胞外小囊泡。直徑為30-150nm的脂質雙分子層結構囊泡。它作為一種重要的細胞間信息傳遞分子及遺傳物質傳遞載體，外泌體內含有多種蛋白質和RNA等物質，廣泛分布于人體血液、尿液、唾液等體液中以及腫瘤細胞培養液中。腫瘤細胞分泌的外泌體可以促進腫瘤血管生成，也可以通過調控腫瘤微環境來影響腫瘤的生長與轉移，外泌體在腫瘤的發展中發揮重要作用。現階段外泌體相關的熒光成像已經成為研究熱點，

考慮到外泌體較小的尺寸(<150nm)，傳統光學顯微鏡存在衍射極限，目前超分辨技術可以克服光學衍射極限問題，光學超分辨成像技術主要包括受激發射損耗顯微技術(STED)，結構光照明顯微技術(SIM)以及單分子定位顯微技術(SMLM)。單分子定位顯微技術(SMLM) 是使用特定的熒光探針，用特定波長的激光來激活熒光分子，然后用另一波長的激光激發熒光分子并成像。其中，控制激光的強度，使得每一幅圖像中都只有少量稀疏的熒光分子被激活，通過計算擬合來精確定位這些單分子熒光的位置信息。目前單分子定位顯微技術主要包括光激活定位顯微技術(PALM)和隨機光學重構顯微技術(STORM)。光激活定位顯微技術主要是利用光激活熒光蛋白或光激活染料標記蛋白質，調節激光器的能量，用低能量的激活光照射細胞，可以激活視野下的幾個熒光分子，而且一次僅激活這幾個熒光分子。然后用激發光檢測，通過高斯擬合來精確定位這些被激活的熒光單分子。這些分子的位置被確定之后再使用激發光長時間照射這些分子，漂白這些已經定位正確的熒光分子，這樣能夠保證在下一輪的激活光照射之下這些分子不能再被激活。通過反復的激活-激發-漂白的循環，持續上千次后，得到細胞內熒光分子的精確定位信息，將這些分子的定位點疊加到一張圖上，最后得到了一張比傳統光學顯微鏡至少高10倍以上分辨率的顯微成像圖。

目前單分子定位超分辨技術用于外泌體研究中，主要是通過外泌體膜上標志性蛋白進行間接免疫熒光(IF)標記以及借助有閃爍功能的細胞膜染料。比如文獻中報道外泌體膜蛋白 CD63首先用一抗標記，然后用標記有Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647的二抗偶聯進行信號放大(Chen etal.ACS Appl Mater Interfaces 2016,8(39),25825-25833),Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647染料，在開關狀態之間可以可逆地進行數百次循環，非常適合使用在PALM/STORM 的超分辨率成像中。這種標記技術存在一定弊端，間接免疫熒光技術進行生物樣品標記需要進行樣本固定處理環節，導致生物樣本自身是沒有活性的。而借助于生物膜染料標記后需要對生物樣品進行純化處理，避免未標記上的染料的干擾。

發明內容

為了解決上述問題，本發明公開一種用于外泌體單分子定位超分辨成像的重組質粒，所述重組質粒由熒光蛋白基因和外泌體膜上標志性CD63蛋白基因進行融合構建而成。

對于上文所述的技術方案，優選的情況下，所述的熒光蛋白選自PAmcherry、Dronpa、 mEos2或mGeos。