[發明專利]雞Ⅱ型星狀病毒環介導等溫擴增檢測引物組、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810983323.5
• 申請日: 2018-08-27
• 公開（公告）號: CN108929919A
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發明（設計）人: 錢琨;喬丹丹;武宗儀;秦愛建;邵紅霞;葉建強;金文杰
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發明屬于生物技術領域，本發明公開了雞Ⅱ型星狀病毒環介導等溫擴增檢測引物組，根據雞Ⅱ型星狀病毒基因組保守序列設計引物：外引物F3和B3，序列見SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2；內引物FIP和BIP，序列見SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。本發明還公開了雞Ⅱ型星狀病毒檢測試劑盒，包括上述引物組。本發明又公開了雞Ⅱ型星狀病毒環介導等溫擴增檢測方法：根據所設計的引物建立一種檢測雞Ⅱ型星狀病毒的環介導等溫擴增方法。本發明的檢測方法具有快速、高效、特異性強、準確性好、靈敏度高、無需昂貴儀器設備，便于基層現場使用，方便快速。

技術領域

本發明涉及一種雞星狀病毒環介導等溫擴增檢測引物組、試劑盒及其檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

星狀病毒科（Astroviridae）分為哺乳動物星狀病毒屬（Mamastrovirus）和禽星狀病毒屬(Avastrovirus)，其中禽星狀病毒屬分為3個種，分別為禽星狀病毒GI.A型、禽星狀病毒GI.B型和禽星狀病毒GII.A型。根據不同來源和基因型，在家禽中鑒定出來6種不同的星狀病毒，包括兩種雞源星狀病毒（禽腎炎病毒（ANV）和雞星狀病毒（CAstV））、兩種火雞源星狀病毒（TAstV-1和TAstV-2）和兩種鴨源星狀病毒（DAstV-1和DAstV-2）。星狀病毒是單股正鏈、無囊膜的小RNA病毒，其基因組長度為6.5-7.5kb，有3個開放閱讀框（ORF），包括閱讀框編碼的無囊膜蛋白（ORF1a）、病毒RNA依賴的RNA聚合酶（ORF1b）和衣殼蛋白（ORF2）。其復制方式與其他腸道病毒在合成次基因組時是截然不同的，在ORF1與ORF2之間存在一個含有絲氨酸蛋白酶的反轉錄移框信號序列，ORF1a和ORF1b之間有一個移動框結構，ORF1編碼一種蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶，ORF2表達亞基因組RNA，編碼病毒的衣殼蛋白，不同血清型之間的結構長短不一。

雞星狀病毒（CAstV）是一種極易在1-5周齡幼禽中流行的腸道病毒，常與其他腸道病毒發生混合感染。對雞群腸道病毒感染情況進行持續監測，發現檢測到的首個陽性樣本往往就是星狀病毒或星狀病毒與其他病毒的混合感染。檢測該病毒的感染情況對于疾病控制和臨床診斷均具有重要意義。因此，一套簡便快速、特異性強的星狀病毒檢測方法，可以為雞腹瀉病的防控和臨床診斷提供有力的技術支持。

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法可在等溫條件下進行高效、快速、高特異性的擴增靶序列，LAMP具有許多獨特的優點：①LAMP技術可以在等溫條件下實現擴增，不需要進行模板的預變性，減少了PCR技術升降溫帶來的影響以及對昂貴、精密實驗儀器的要求，同時擴增效率高。②LAMP技術擴增的特異性非常高，使用的特異性引物可以識別目的序列上特異性的區域，對目的序列具有高度的選擇性，減少了非靶標序列的影響。③陽性擴增反應中會產生大量的焦磷酸鎂白色沉淀，擴增產物的檢測方法多樣，可用凝膠電泳檢測、直接用肉眼檢測或在反應體系中加入染料，根據顏色的變化通過熒光照射裝置進行紫外光照射檢測；還可以利用濁度儀，根據擴增產物混濁度的不同對原始核酸分子進行實時定量分析。此外，LAMP方法還具有特異性強，靈敏度較PCR方法高，無需PCR儀器等貴重儀器，僅需要普通水浴鍋調節溫度（60℃～66℃），大大降低了檢測的費用，特別適合基層現場使用。目前，還未見針對雞Ⅱ型星狀病毒LAMP方法的相關研究報道，本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

發明內容

本發明的目的在于提供一種雞Ⅱ型星狀病毒環介導等溫擴增檢測引物組、試劑盒及其檢測方法，應用該引物組可為基層現場檢測提供一種簡便、快捷的檢測雞Ⅱ型星狀病毒的方法。

本發明的第一個目的是通過以下技術方案來實現的：