[發明專利]一種特異性標記納卡變形微孢子蟲的核酸探針及其熒光原位雜交檢測方法在審
| 申請號： | 201810982201.4 | 申請日： | 2018-08-27 |
| 公開（公告）號： | CN109082474A | 公開（公告）日： | 2018-12-25 |
| 發明（設計）人： | 李田;房卓亞;羅堿;徐金智;周澤揚 | 申請（專利權）人： | 西南大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12Q1/6841;C12N15/11 |
| 代理公司： | 重慶知創恒源知識產權代理事務所(普通合伙) 50227 | 代理人： | 王貴君 |
| 地址： | 400715*** | 國省代碼： | 重慶;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 核酸探針 微孢子蟲 變形 寄生 熒光原位雜交 細胞核 種特異性 雜交 病原 熒光探針標記 核苷酸序列 熒光顯微鏡 脫色 發育階段 原位雜交 靈敏度 雜交液 檢測 家蠶 孢子 清洗 觀測 直觀 感染 成熟 | ||
1.一種特異性標記納卡變形微孢子蟲的核酸探針，其特征在于：所述核酸探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據權利要求1所述一種特異性標記納卡變形微孢子蟲的核酸探針，其特征在于：所述核酸探針的5’端或3’端標記紅色熒光染料。
3.根據權利要求2所述一種特異性標記納卡變形微孢子蟲的核酸探針，其特征在于：所述紅色熒光染料為Cy3。
4.根據權利要求1所述一種特異性標記納卡變形微孢子蟲的核酸探針，其特征在于：所述探針為Cy3-gtattctattacgaccttc-3'。
5.利用權利要求1～4任一項所述核酸探針特異性標記家蠶寄生囊組織納卡變形微孢子蟲的熒光原位雜交方法，其特征在于，具體步驟如下：取感染納卡變形微孢子蟲的家蠶寄生囊組織，進行固定后進行脫色處理，然后加入含所述核酸探針的雜交液進行雜交，雜交結束清洗，然后用DAPI對寄生囊的細胞核以及納卡變形微孢子蟲的細胞核進行標記，再用熒光顯微鏡，觀測熒光探針標記結果。
6.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于：所述感染納卡變形微孢子蟲的家蠶寄生囊組織由以下方法制備：將納卡變形微孢子蟲均勻涂抹于桑葉上，以105個孢子/蠶的量添食三齡家蠶，五齡后撕取家蠶中腸后部白色瘤狀的寄生囊顆粒。
7.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于：所述固定為用質量分數為4％的多聚甲醛固定；所述脫色是以體積分數為6％的H2O2為脫色液脫色2h。
8.根據權利要求7所述的熒光原位雜交方法，其特征在于：所述脫色液是由體積分數30％的H2O2用乙醇稀釋為體積分數為6％的H2O2。
9.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于：所述雜交是用雜交液將核酸探針稀釋至濃度為5ng/μL，加入到脫色的寄生囊組織中，于46℃避光雜交12小時；所述雜交液各組分濃度如下：900mM NaCl，20mM Tris，0.01％SDS，pH為7.5。
10.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于：所述清洗為利用雜交清洗液于48℃清洗1小時30分鐘清洗非特異性結合的探針，所述雜交清洗液各組分濃度如下：900mM NaCl，20mM Tris，0.01％SDS，5mM EDTA，pH為7.5。
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